1,1,6-三甲基-4,6-二氮螺[2.4]庚烷-5,7-二酮抗癲疒間藥理活性研究

熊 琳，朱 軍，李 鵬，陳琴華*

·藥學研究·

1,1,6-三甲基-4,6-二氮螺[2.4]庚烷-5,7-二酮抗癲疒間藥理活性研究

熊 琳1,2，朱 軍1,2，李 鵬1,2，陳琴華1,2*

目的 從合成的大量化合物中篩選抗驚厥活性比較好的化合物，為新型抗癲疒間藥物的開發提供依據。方法 以乙內酰脲類化合物為母核，對其化學結構進行改造優化，合成1,1,6-三甲基-4,6-二氮螺[2.4]庚烷-5,7-二酮(MPVM)。采用最大電休克驚厥實驗(MES)、皮下注射戊四氮(PTZ)實驗、最大電休克驚厥閾值實驗、戊四氮(ipPTZ)閾值實驗評價MVPM化合物的抗驚厥活性。結果 MVPM化合物抗MES、PTZ的ED50分別為14.7、41.7 mg/kg。MVPM化合物可提高小鼠最大電驚厥發作閾值，提高小鼠驚厥的耐受性，并且呈現劑量依賴性。結論 該化合物抗癲疒間活性好，具有進一步研究開發的價值。

1,1,6-三甲基-4,6-二氮螺[2.4]庚烷-5,7-二酮；抗癲疒間；藥理活性；MES；PTZ

0 引言

癲疒間是神經混亂疾病中比較常見的一種，在世界范圍內，約有5 000多萬例患者，發病率與很多疾病相比較高(約0.5%～1.0%)，死亡率約為1.0%～3.0%。雖然目前已經有許多治療效果較好的抗癲疒間藥物，仍然有大部分癲疒間患者的病情不能得到有效的控制。

乙內酰脲類衍生物具有多種藥理活性，如抗驚厥作用、抑制血小板凝聚、抗心律失常、抗病毒、拮抗細胞黏連等。本課題組一直致力于乙內酰脲衍生物的合成和藥理活性的研究，從已經合成的大量化合物中篩選出抗驚厥活性比較好的化合物[1-2]，本試驗就化合物1,1,6-三甲基-4,6-二氮螺[2.4]庚烷-5,7-二酮(MPVM)作為抗癲疒間藥物的研究與開發價值進行初步成藥性研究，得到該化合物的初步評價。

目前，在抗癲疒間藥物篩選過程中，通常采用三種模型，包括最大電驚厥(MES)、戊四氮誘導的發作模型(PTZ)以及點燃模型(Kindling model)。這些模型可以在小鼠、大鼠、狗、猴子等動物體內建立。在這些篩選模型中，研究新的抗癲疒間藥物普遍采用的是MES和皮下注射PTZ(scPTZ)發作模型[3-5]。MES和scPTZ模型用于篩選抗驚厥藥物的優點較多。首先，這兩種模型容易操作，可以大量篩選，需要的設備投資最小，技術含量要求不高；此外，通過這兩種方法獲得的數據比較有價值，能夠作為抗驚厥化合物的評判依據。在目前上市的抗癲疒間藥物中，除了乙拉西坦(LEV)[6-7]，其他藥物在這兩種模型至少有一種是具有活性的。

1 合成試驗

1.1 儀器與試藥 RE-5298型旋轉蒸發儀(上海亞榮儀器廠)，GF-254硅膠(青島海洋化工廠)，XT-4型顯微熔點測定儀(上海濟成分析儀器有限公司)，其他試劑均為國藥化學純(CP)或分析純(AR)。

1.2 方法 合成路線：見圖1。具體合成方法參考文獻[2]。

圖1 合成路線圖

2 藥理試驗

2.1 材料 YSD-4G型藥理生理實驗多用儀(安徽正華生物儀器設備有限公司)。電子天平，小鼠鼠籠、灌胃針頭、注射針頭，1 mL注射器若干。SPF級昆明小鼠，體重18～22 g，雌雄各半，由武漢大學動物實驗中心提供。實驗前1周飼養于鼠籠中，自由進食和純凈水。飼養條件為自由光照，溫度(23±3)℃，相對濕度55%±5%。1周的試驗條件飼養之后，小鼠根據試驗所需只數隨機分組，每只小鼠只用1次且所有的試驗在8∶00～16∶00進行。

2.2 方法 抗癲疒間藥理試驗采用美國國立衛生院公布的抗癲疒間藥物開發程序[8-9]先進行Ⅰ期藥理試驗，結果表明，該化合物具有較好的藥理活性[10]，具有開發價值，可以進行下一步試驗，為臨床試驗提供更為具體可靠的信息。本試驗采用4種藥理模型，最大電休克驚厥實驗(MES)、皮下注射戊四氮(PTZ)實驗、最大電休克驚厥閾值實驗、戊四氮(ipPTZ)閾值實驗評價MVPM化合物的抗驚厥活性。

2.2.1 最大電休克驚厥實驗(MES) 在實驗的前1 d使用YSD-4GA藥理生理實驗多用儀對飼養1周的小鼠進行篩選，篩選條件：50 mA，60 Hz，0.2 s。先將小鼠的兩耳涂上一定量的注射用生理鹽水，以保證鼠耳有良好的導電性能。用耳緣電極夾住小鼠兩側耳尖部即可通電，給予電刺激篩選出出現后肢強直的合格小鼠，即可用于下一步的活性測定實驗。

實驗步驟：取實驗前1 d篩選合格的昆明小鼠，隨機分成5組，每組10只，雄雌各半。按照預試驗結果，設計梯度濃度，分別給予不同劑量的化合物，每組均采用腹腔注射給藥。給藥1 h后使用YSD-4GA藥理生理實驗多用儀在相同條件下給予小鼠電刺激，觀察記錄小鼠電刺激之后的實驗行為。MPVM在該劑量下是否具有抗驚厥活性取決于小鼠的行為，若小鼠出現后肢強直則此劑量下無效，反之則有效。見表1。

表1 MPVM對抗小鼠MES驚厥ED50實驗結果(n=10)

注：MESa，最大電驚厥

2.2.2 皮下注射戊四氮(PTZ)實驗 實驗小鼠(雌雄各半)隨機分為空白組、受試MPVM組，每組10只?？瞻捉M注射等量溶媒，受試MPVM組腹腔注射化合物，1 h后，每組小鼠皮下注射85 mg/kg戊四氮。每組小鼠按照雌雄分別放于2個鼠籠中觀察0.5 h。分別記錄每組小鼠的行為情況，包括陣攣、強直和死亡的個數。

表2 MPVM對抗小鼠PTZ誘導驚厥ED50實驗結果(n=10)

2.2.3 最大電休克驚厥閾值實驗 為了評估最大電驚厥閾值，將小鼠隨機分為4組，每組10只，用不同強度的電刺激，篩選10%～30%、30%～50%、50%～70%和70%～90%的發作小鼠。根據這些數據，計算出半數電流強度(CS50/mA)。

實驗步驟：①空白對照：取40只SPF級昆明小鼠，隨機分為4組，每組10只。每只小鼠用藥前自身作為空白對照，小鼠腹腔注射一定量的溶媒，1 h后給予電刺激，根據小鼠的反應改變電流強度，記錄小鼠驚厥發作閾值(CS50，mA)。②給MPVM后發作閾值實驗：小鼠電驚厥后，至少隔48 h后才能進行第2次電驚厥實驗。小鼠腹腔注射受試MPVM不同劑量。1 h后給予電刺激，觀察并記錄小鼠出現驚厥的電流強度，記錄給藥后小鼠發作閾值(CS50)，實驗結果見圖2。

圖2 不同濃度MPVM對MES閾值改變(n=10)

2.2.4 戊四氮(ipPTZ)閾值實驗 為了評價藥物抗驚厥的活性，采用腹腔注射PTZ判斷化合物對于提高機體對驚厥耐受性的指標。該模型能夠評價一個藥物調整發作閾值的效果。首先給小鼠一定劑量的化合物，然后腹腔注射不同劑量的PTZ，觀察小鼠的發作閾值。

實驗步驟：實驗小鼠隨機分為空白組、受試化合物MPVM組、對照品卡馬西平組，每組按照表3中PTZ劑量分組，每組8只。空白組小鼠腹腔注射溶媒，受試MPVM組腹腔注射MPVM劑量為50 mg/kg，卡馬西平組腹腔注射卡馬西平劑量為100 mg/kg。1 h后開始腹腔注射PTZ，之后，小鼠可以在鼠籠自由活動以免影響觀察閾值。觀察30 min并記錄小鼠的行為，以出現全身陣攣為觀察指標。

表3 MPVM PTZ誘導癲疒間閾值發作實驗結果(n=8)

3 討論

MES試驗中，MPVM的ED50為14.7 mg/kg，其半數有效量小于臨床上常用的苯妥英，活性與苯巴比妥相當，強于丙戊酸鈉。PTZ試驗中，MPVM在PTZ誘導驚厥試驗模型中的ED50為41.7 mg/kg；在PTZ誘導的癲疒間模型中，能夠顯著提高小鼠的癲疒間閾值，延長小鼠癲疒間發作潛伏期，雖然其對小鼠癲疒間發作死亡保護不及卡馬西平，但其有效劑量遠遠低于卡馬西平。MES閾值試驗中，MPVM能夠提高小鼠最大電驚厥發作閾值，并且呈現劑量依賴性。MPVM在腹腔注射25 mg/kg 1 h后，能夠顯著提高小鼠的電驚厥閾值：由6.7 mA提高到9.5 mA。PTZ閾值試驗中，MPVM能夠影響PTZ誘導的小鼠驚厥，與卡馬西平相比，能夠顯著提高小鼠驚厥的耐受性，使得在此模型中小鼠CD50為75.3 mg/kg，而卡馬西平為66.9 mg/kg。

抗癲疒間的動物模型種類較多，如：①局部運用γ-氨基丁酸受體拮抗劑(青霉素、木防己苦毒素等)；②點燃致驚模型；③化學點燃模型(海人酸、戊四氮等)；④MES和scPTZ模型。由于本實驗室條件有限、一些藥物是管制品難以購買及實驗技術限制，使得MPVM作為抗癲疒間藥物的藥理活性評估所用模型較少。未來應進行更大規模、更多藥理模型的試驗。

Antiepileptic pharmacological activity of 1,1,6-trimethyl-4,6-diaza-spiro[2.4] heptan-5,7-dione

XIONG Lin1,2,ZHU Jun1,2,LI Peng1,2,CHEN Qin-hua1,2*

(1.Department of Pharmacy,Affiliated Dongfeng Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442008,China;2.Institute of Pharmaceutical Analysis and Drug Screening,Hubei University of Medicine,Shiyan 442008,China)

Objective To survey the pharmacological action of 1,1,6-trimethyl-4,6-diaza-spiro [2.4] heptan-5,7-dione.Methods The chemical structure of hydantoin was modified to obtain analogs-1,1,6-trimethyl-4,6-diaza-spiro [2.4] heptan-5,7-dione(MPVM) and examine the anticonvulsant activities of MPVM by MES test,PTZ test,electroconvulsive threshold test,PTZ-evoked seizure test.Results MVPM antagonized MES(ED50=14.7 mg/kg)and PTZ(ED50=41.7 mg/kg).MVPM could also raise mice′s electroconvulsive threshold and PTZ-evoked seizure threshold.Conclusion The compound has a good antiepileptic activity,it deserves for a further research with good development.

1,1,6-trimethyl-4,6-diaza-spiro [2.4] heptan-5,7-dione;Atiepileptic;Parmacological activity;MES;PTZ

2014-12-18

1.湖北醫藥學院附屬東風醫院藥學部，湖北 十堰 442008；2.湖北醫藥學院藥物分析與篩選研究所，湖北 十堰 442008

湖北省衛生廳青年科技人才項目(QJX2012-45)

10.14053/j.cnki.ppcr.201507015

*通信作者