DNA異倍體檢測在肺癌早期診斷中的價值

樊　娜　張玉萍　孟　夏　鄧文靜

明宗娟　石　婕　李　維　史紅陽

王　薇　鐘玉潔　方　萍　楊拴盈

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·論著·

DNA異倍體檢測在肺癌早期診斷中的價值

樊娜張玉萍孟夏鄧文靜

明宗娟石婕李維史紅陽

王薇鐘玉潔方萍楊拴盈

惡性腫瘤嚴重威脅著人類的生命與健康, 而肺癌是我國乃至世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一[1]。近年來，肺癌的發病率呈明顯的上升趨勢，已成為當今癌癥死亡的主要原因[2-3]。而目前肺癌早期診斷率低，僅僅為15%[4]。惡性胸腔積液是肺癌最常見的并發癥之一，預后差，中位生存期僅為4個月[5]。國際肺癌研究聯合會建議將伴有惡性胸水的非小細胞肺癌定于Ⅳ期[6]。因此，肺癌的早期診斷及胸腔積液良、惡性的鑒別在臨床上具有極其重要的意義。臨床一般用細胞學檢查尋胸水找癌細胞確診肺癌。但由于細胞學檢查工作量大、效率低，且要有專業培訓、及有足夠工作經驗的臨床病理專家才能做出確診。胸水細胞學檢查診斷陽性率也僅約60%，而陰性并不能排除腫瘤診斷[7]。DNA異倍體分析原理是：細胞核DNA的測量是通過細胞核積分光密度測定的，主要定量測定細胞或組織化學反應后的最終反應產物的量，并以標準細胞為參照物，計算出定量檢測結果，反映細胞核DNA的相對含量[8]。本研究通過將DNA異倍體分析、腫瘤標志物檢測結果與細胞學檢測結果進行比較，旨在探討DNA異倍體在肺癌、惡性胸腔積液診斷中的價值。

資料與方法

一、臨床資料

收集西安交通大學第二附屬醫院病理科2013年1月至2014年9月支氣管鏡刷檢、活檢、及手術切除病例共280例(男173例、女107例，年齡19～81歲)，胸腔積液399例(男276例，女123例，年齡14～88歲)。所有病例均經活檢組織學診斷和/或臨床確診。

二、研究方法

1. 樣本取材及制片：采用Olympus BF-1T260型電子纖維支氣管鏡進行常規刷檢和活檢，刷取物常規涂片4～6張用10%甲醛常規固定、其余刷取物加入麥克奧迪DNA分析樣本處理瓶中固定，活檢組織、經皮肺穿活檢或術后標本組織樣本采用10%甲醛固定、常規制片。

2. 診斷：支氣管刷片和活檢組織均經HE染色由具有臨床資質的病理醫師閱片并按照WHO標準進行病理診斷，其中刷片診斷分為：正常、不典型增生、癌疑、癌，以不典型增生、癌疑、癌為陽性判斷標準。

3. 細胞DNA定量分析：將固定后的DNA檢測樣本離心、取沉淀，重懸滴片、自然風干、固定，Feulgen染色，質控片采用大鼠肝細胞片作對照。按照麥克奧迪全自動細胞DNA定量分析系統操作說明進行參數設定、玻片掃描和分析。以DNA指數(DNA Index，DI)表示DNA含量，以DI>2.5判讀為異倍體細胞(aneuploidy)，并按①陽性病例：異倍體細胞數≥3個、或可見細胞異倍體峰( 在1.05

三、統計學分析

采用SPSS19.0軟件進行χ2檢驗，以P<0.05表示有統計學差異，同時計算靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值。

結果

一、活檢、常規支氣管刷片、全自動DNA定量分析結果

在該組病例中，活檢和臨床證實良性病變患者158例(包括支氣管黏膜炎141 例、肺結核11例、結節病2例、支氣管息肉1例、炎性假瘤1例、肺隔離癥1例、矽肺1例)，肺癌患者共122例(包括鱗癌46例、腺癌23例、小細胞未分化癌20例、找到癌細胞但無具體分型者10例和其他經臨床診斷23例)；組織病理學檢查陰性者占64.64%(181/280)、陽性者(確診為癌)占35.36%(99/280)；血清癌胚抗原(carcino embryonie antigen, CEA)檢測陰性者(≤3.4 ng/ml)占70.71%(198/280)，陽性者(>3.4 ng/ml)占29.29%(82/280)。采用全自動細胞DNA定量分析系統檢測發現280例支氣管刷檢樣本中DNA定量分析檢測，DI≥3者占22.85%(64/280)、DI為1～2者占11.79%(33/280)、DI為0者占65.36%(183/280)。統計學分析結果顯示：全自動細胞DNA定量分析在與組織學檢測、細胞學檢測及血清CEA檢測方法之間比較無統計學差異(P>0.05)。

二、病理活檢、常規支氣管刷片血清CEA檢測與全自動DNA定量技術敏感度和特異度分析

以活檢和臨床證實的肺癌診斷作為金標準，以活檢為陽性值，計算活檢的靈敏度為81.1%，特異度為100%；以DI≥1作為陽性界值計算全自動細胞DNA定量分析技術的的靈敏度為60.7%、特異度為85.4%；而在常規纖維支氣管刷片中，以不典型細胞、癌疑細胞和癌細胞合計作為陽性細胞計算的常規纖維支氣管鏡刷片的靈敏度為75.4%、特異度為100%；血清CEA檢測的靈敏度為54.1%，特異度為91.8%，見表1。

三、 胸腔積液細胞學檢查、全自動DNA定量分析、血清CEA及胸水CEA結果

在該組病例中，活檢和臨床證實良性病變患者259例(包括結核性滲出性胸膜炎160例、炎性胸腔積液64例、漏出液35例)，惡性胸腔積液患者共140例(包括鱗癌12例、腺癌47例、小細胞未分化癌22例、找到癌細胞但無具體分型者14例和其他經臨床診斷者45例)；組織病理學檢查陰性者占76.19%(304/399)、陽性者(確診為癌)占23.81%(95/399)。血清CEA檢測陰性者(≤3.4 ng/ml)占69.42%(277/399)，陽性者(>3.4 ng/ml)占30.58%(122/399)；胸水CEA檢測陰性者(≤3.4 ng/ml)占67.92%(271/399)，陽性者(>3.4 ng/ml)占32.08%(128/399)。采用全自動細胞DNA定量分析系統檢測發現399例胸腔積液樣本中DNA定量分析檢測，DI≥3者占20.55%(82/399)、DI為1-2者占7.52%(30/399)、DI為0者占71.93%(287/399)。統計學分析結果顯示：全自動細胞DNA定量分析在與組織學檢測、傳統細胞學檢測及血清/胸水CEA等檢測方法之間均無統計學差異(P>0.05)。

四、 胸水細胞病理學與全自動DNA定量技術及血清、胸水CEA檢測敏感度和特異度分析

以活檢和臨床證實的結果作為金標準，組織病理學的靈敏度為67.9%，特異度為100%；在胸水脫落細胞學檢查中，以不典型細胞、癌疑細胞和癌細胞合計作為陽性細胞計算的脫落細胞學檢查的靈敏度為83.6%，特異度為100%；以DI≥1作為陽性界值計算全自動細胞DNA定量分析技術的的靈敏度為62.1%、特異度為90.3%；血清CEA檢測的靈敏度為75.7%，特異度為93.8%；胸水CEA檢測的靈敏度為90.2%，特異度為99.2%，見表2。

表1　四種檢測方法診斷肺癌的效果比較

表2　五種檢測方法診斷胸腔積液的效果比較

五、腫瘤分期與DNA定量分析的相關性結果

根據TNM分期將所選病例中病理確診及臨床確診肺惡性腫瘤患者進行分期，可以看出，早期肺癌(Ⅰ和Ⅱ)與晚期肺癌(Ⅲ和Ⅳ)在DNA異倍體的分布上無明顯統計學差異(P>0.1)，見表3。

表3　肺癌分期與DNA定量分析的關系

討論

正常人體細胞DNA含量多為二倍體細胞，DNA含量恒定，大約為7pg。而由致癌因素導致的基因丟失、突變、異常擴增或染色體移位、融合等被認為是腫瘤發生的早期分子事件，可導致細胞DNA含量的增加。因此，測定細胞DNA的含量，發現異常細胞，成為應用DNA異倍體進行腫瘤早期診斷的理論基礎[9-11]。

一般認為，一旦檢測到DI>2.5的異倍體細胞，或出現較多DI值為1.1～1.9的異倍體細胞，且聚集成峰，提示存在惡性瘤細胞。目前，DNA-ICM技術以其較高的敏感性和特異性已被用于包括宮頸在內的多種類型脫落細胞學標本的檢測和惡性實體腫瘤惡性程度的評估。并已證實，DI和異倍體細胞數與細胞增殖、惡性程度及不良預后呈正相關[12-15]。

本研究采用麥克奧迪生產的MotiCytometer全自動細胞DNA 圖像定量分析系統對280例肺部疾病患者的支氣管鏡刷檢、活檢組織(支氣管鏡活檢、手術切除)標本進行細胞DNA含量檢測，發現全自動細胞DNA定量分析技術與常規活檢和常規支氣管鏡刷片檢測之間無統計學差異。以活檢和臨床證實的肺癌診斷作為金標準，以活檢為陽性值，計算活檢的靈敏度為81.1%，特異度為100%；以DI≥1作為陽性界值計算全自動細胞DNA定量分析技術的的靈敏度為79.5%、特異度為85.4%；而在常規纖維支氣管刷片中，以不典型細胞、癌疑細胞和癌細胞合計作為陽性細胞計算的常規纖維支氣管鏡刷片的靈敏度為75.4%、特異度為100%；血清CEA檢測的靈敏度為56.6%，特異度為91.8%如表1。將DNA定量分析的結果分別與組織病理、細胞病理及血清CEA檢測的結果進行對比，可以發現，DNA異倍體的檢測與病理學(組織及細胞)檢測無論是在敏感度、特異度，還是在陽/陰性預測值的結果上，其差異都是具有統計學意義的，而與血清CEA的檢測結果無統計學差異。也就是說，DNA異倍體的檢測的敏感性及特異性均不及病理學檢測。

同樣應用該DNA 圖像定量分析系統對399例胸腔積液標本進行DNA含量測定，發現全自動細胞DNA定量分析在與組織學檢測、傳統細胞學檢測及血清/胸水CEA等檢測方法之間均無統計學差異(P>0.05)。以活檢和臨床證實的結果作為金標準，組織病理學的靈敏度為67.9%，特異度為100%；在胸水脫落細胞學檢查中，以不典型細胞、癌疑細胞和癌細胞合計作為陽性細胞計算的脫落細胞學檢查的靈敏度為83.6%，特異度為100%；以DI≥1作為陽性界值計算全自動細胞DNA定量分析技術的的靈敏度為62.1%、特異度為90.3%；血清CEA檢測的靈敏度為75.7%，特異度為93.8%；胸水CEA檢測的靈敏度為90.2%，特異度為99.2%如表2。將DNA異倍體檢測結果分別與組織病理、細胞病理、胸水CEA及血清CEA檢測結果進行比較，我們發現，DNA異倍體結果與細胞病理學及胸水CEA檢測結果均具有統計學差異，無論是敏感性還是特異性均不及細胞病理及胸水CEA，而與血清CEA檢測結果無統計學差異。在與組織病理學的比較中，可以看出，在敏感度及陰性預測值上，兩者無統計學差異，而在特異度及陽性預測值方面具有統計學差異，出現這樣的結果可能與陽性結果的樣本量偏少有關。

對本組679例標本進行綜合分析，根據TNM分期將所選病例中病理確診及臨床確診肺惡性腫瘤患者進行分期，可以看出，早期肺癌(Ⅰ和Ⅱ)與晚期肺癌(Ⅲ和Ⅳ)在DNA異倍體的分布上無明顯統計學差異(P>0.1)如表3，但隨著肺癌的進展，DNA異倍體的檢出率呈明顯升高的趨勢。由此推測，DNA異倍體的出現可能系肺癌發生的早期事件。

總之，全自動DNA定量分析技術是一種較敏感而特異的肺癌的篩查技術，與臨床常用的血清CEA檢測方法在結果上不具有統計學差異，雖然其靈敏度及特異度均較病理學檢測結果偏低，但其方法簡單，便于操作，風險小等優點亦可顯著提高支氣管鏡刷檢及腫瘤標志物CEA的陽性檢出率。因而，檢測DNA異倍體有望作為肺癌早期診斷與篩查的有價值的標志物。

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(本文編輯：黃紅稷)

樊娜，張玉萍，孟夏，等. DNA異倍體檢測在肺癌早期診斷中的價值[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(6)： 684-688.

【摘要】目的探討DNA異倍體檢測在肺癌篩查和早期診斷中的應用價值。方法對679例肺部疾病患者的支氣管鏡刷檢、活檢組織(支氣管鏡活檢、手術切除)標本(280例)及胸腔積液脫落細胞399例經常規處理、HE染色，進行病理學檢查，采用Motic全自動細胞DNA定量分析系統檢測標本中的DNA異倍體，同時分別測定血清、胸腔積液中腫瘤標志物CEA含量。結果全自動細胞DNA定量分析與組織學檢測、細胞學檢測及血清癌胚抗原(CEA)檢測結果之間比較無統計學差異(P>0.05)；DNA異倍體的檢測結果與胸腔積液的病理學檢測、脫落細胞學檢測及血清/胸水CEA等檢測結果之間亦無統計學差異(P>0.05)。其中，DNA異倍體檢測靈敏度及特異度均略低于常規支氣管刷片，而與血清CEA檢測結果無差異；胸水中DNA異倍體檢測的靈敏度與特異度亦均低于胸水脫落細胞學及胸水CEA檢測，但與血清CEA檢測結果無差異。同時，DNA異倍體在早期及晚期肺癌的檢出結果中未見明顯統計學差異(P>0.1)。結論全自動DNA定量分析技術是一種敏感而特異的肺癌的篩查技術；DNA異倍體可能屬于肺癌發生的早期事件，檢測DNA異倍體有望作為肺癌早期診斷與篩查的有價值的標志物；DNA異倍體與支氣管鏡刷檢或與CEA聯合檢測可提高肺癌診斷的陽性率。

【關鍵詞】支氣管肺癌；胸腔積液；DNA異倍體；腫瘤標志物

value of DNA heteroploid in screening and early diagnosis of lung cancerFanNa,ZhangYuping,MengXia,DengWenjing,MingZongjuan,ShiJie,LiWei,ShiHongyang,WangWei,ZhongYujie,FangPing,YangShuanying.RespiratoryMedicine,theSecondAffiliatedHospitalXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004China

Correspondingauthor：YangShuanying,Email:yangshuanying66@163.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the value of DNA heteroploid in screening and early diagnosis of lung cancer. MethodsAll 280 biopsy samples and 399 exfoliocytology of pleural effusion samples were collected and underwent routine treatment, HE staining and pathological examination. Using Motic automatic cell DNA quantitative analysis system to detect DNA heteroploid in the samples. Meanwhile the carcino embryonie antigen(CEA) were measured both in serum and pleural effusion. ResultsThere was not a statistical significance in methodology between Motic automatic cell DNA quantitative analysis, cytology examination, histology examination and CEA measurement(P>0.05). The methodology of detecting DNA heteroploid in exfoliocytology, pathology and CEA measurement shows no statistical significance(P>0.05). The sensitivity and specificity of DNA heteroploiddetection was inferior compared with bronchial brushing, but no diffirence with the serum-CEA. The measurement of DNA heteroploid in pleural effusion has a lower sensitivity and specificity than exfoliocytology and pleural effusion-CEA, but no diffirence with serum-CEA. Meanwhile, there is no statistical significance of DNA heteroploid detection both in early stage and advanced stage of lung cancer. ConclusionsAutomatic cell DNA quantitative analysis can be a screening technology for lung cancer with high sensitivity and specificity. DNA heteroploid may occur in the early genesis of lung cancer and has a hope to become a biomarker for early diagnosis of lung cancer. The combination of DNA heteroploid, bronchial brushing and CEA can enhance the diagnosis rate of lung cancer.

【Key words】Lung cancer;Pleural effusion;DNA heteroploid;Tumor markers

(收稿日期：2015-11-06)

中圖法分類號：R563

文獻標識碼：A

通訊作者：楊拴盈，Email: yangshuanying66@163.com

基金項目：西安交通大學醫院第二附屬醫院科研基金資助[YJ(QN)201408]
作者單位： 710004 西安，西安交通大學第二附屬醫院呼吸內科

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.06.003