特發性肺纖維化患者外周血中CD4+Foxp3+調節性T細胞表達水平分析

史紅陽　鄧文靜　張玉萍　鐘玉潔

劉　昀　方　萍　張德信

?

·論著·

特發性肺纖維化患者外周血中CD4+Foxp3+調節性T細胞表達水平分析

史紅陽鄧文靜張玉萍鐘玉潔

劉昀方萍張德信

(XJJ2012057)

西安交通大學醫學院第二附屬

醫院科研基金(Yj(QN)201101)

作者單位： 710004 西安，西安交通大學第二附屬醫院呼吸內科

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)系指特發性間質性肺炎(idiopathic interstitial pneumonia, IIP)中病理表現為尋常型間質性肺炎的一種類型，在IIP中最常見，約占IIP的47%～71%，病變局限于肺部，通常為隱匿性起病，最初主要的癥狀是干咳和勞力性氣促[1]。隨著肺纖維化的發展，發作性干咳和氣促逐漸加重，最終導致肺功能損害和呼吸困難[2]。其病理特點主要是病變在肺內分布不均一，以下肺和胸膜下區域病變明顯，以大量的成纖維細胞聚集、細胞外基質沉積并伴有炎癥和組織損傷所致的結構破壞為特征。發病機制尚不完全清楚，可能與接觸粉塵或金屬、自身免疫、慢性反復的微量胃內容物吸入、病毒感染和吸煙等因素有關，遺傳因素也可能發揮了一定作用[3-6]。調節性T細胞(regulatory T cell, Treg)是日本學者Sakaguchi首先報道的一群CD4+細胞亞群，Foxp3是Treg細胞發育和成熟的關鍵的調控因子，在Treg細胞的分化和功能中起關鍵作用。目前研究證實Treg細胞在腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、移植免疫等方面發揮了重要作用[7-8]。國內外學者通過實驗發現肺纖維化動物模型肺組織及外周血中Treg細胞數量明顯降低，提示Treg細胞可能在肺纖維化發病過程中發揮了重要作用[9-17]。本實驗擬通過對特發性肺纖維化患者外周血CD4+Foxp3+Treg細胞、Foxp3及TGF-β1的檢測，探討Treg細胞在特發性肺纖維化中的作用。

對象與方法

一、研究對象

選取2014年1月至2014年11月在我院呼吸內科住院確診的特發性肺纖維化患者36例，其中男性23例，女性13例，年齡36～71歲，平均年齡(59.3±11.6)歲。所有病例診斷均符合2011 年美國胸科協會( ATS) 、歐洲呼吸學會( ERS) 、日本呼吸學會( JRS) 和拉丁美洲胸科學會( ALAT) 共同推薦的IPF診治共識中的診斷標準[18]。排除標準：①家庭、職業環境暴露相關的肺纖維化、結締組織病繼發的肺纖維化、藥物及放射相關的肺纖維化；②合并惡性腫瘤；③合并或診斷為慢性慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、支氣管擴張、肺膿腫、活動性肺結核、肺癌、結節病等；④合并嚴重的心臟、肝臟、腎臟及血液系統疾??；⑤近期合并感染性疾?。虎奕焉锘虿溉槠趮D女；⑦合并精神疾病。所有患者在采樣前均未進行糖皮質激素及其他免疫抑制劑治療。同期在我院健康體檢中心進行健康體檢者40例作為正常對照組，其中男性25例，女性15例，年齡38～66歲，平均年齡(55.8±10.7)歲。兩組研究對象性別、年齡的比較差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究得到我院倫理委員會批準并取得所有研究對象的知情同意。

二、研究方法

無菌采取EDTA抗凝靜脈血5.0 ml，以離心半徑8 cm，2 000 r/min 離心10 min后分離血漿，-80 ℃保存，利用人淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，調整為濃度1×106個/ml的單細胞懸液，一部分用于流式細胞檢測，一部分用于PCR檢測。

1. 流式細胞術檢測CD4+Foxp3+Treg細胞百分率： 取500 μl單細胞懸液，避光加入20 μl FITC-CD4抗體，混勻后常溫下孵育20 min；PBS液洗滌3次，以離心半徑8 cm，1 500 r/min 離心10 min后加入4 ℃ 2.0 ml 1xHuman Foxp3 buffer A，震蕩混勻，常溫避光孵育10 min，再加入0.5 ml Human Foxp3 buffer C，PBS液洗滌3次，PBS重懸細胞，加入20 μl PE-Foxp3抗體或同型對照抗體，常溫避光孵育30 min，PBS液洗滌3次重懸細胞。利用流式細胞儀(FACS Calibur)進行檢測，以CD4+T細胞為門進行分析，每一樣品檢測1×104個細胞，收集分析數據。

2. 實時定量RT-PCR檢測Foxp3 mRNA的水平： 取1.0 ml 單細胞懸液，以離心半徑8 cm，1 500 r/min 離心10 min后棄上清，加入1.0 ml TRIzol液提取細胞總RNA，提取的RNA溶于20 μl的DEPC水，嚴格按照試劑盒說明進行操作。取6.0 μl 總RNA、2.0 μl隨機六聚體引物及10 μl DEPC水，混勻后70 ℃孵育5 min，立即冰上冷卻，分別加入5×反應緩沖液5.0 μl、20 U/μl RNase抑制劑2.0 μl、10 mmol/L dNTP 2.0 μl，25 ℃孵育5 min，加入1.0 μl RevertAid M-MμlV RTase，45 ℃孵育60 min，70 ℃孵育5 min，冰上冷卻以終止反應，獲得的cDNA第一鏈在-20 ℃保存。

根據Foxp3及內參GAPDH基因序列利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，Foxp3 5′- TCCAGGACAGGCCACATTTC-3′，5′-GACACCATTTG

CCAGCAGTG-3′，產物大小308 bp；GAPDH 5′- AAT GGGCAGCCGTTAGGAAA-3′， 5′-GCGCCCAATACGA CCAAATC-3′，產物大小168 bp。20 μl PCR反應體系如下：2 μmol/L PCR上下游引物各2.0 μl、2×SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ反應液10 μl、cDNA模板4.0 μl及ddH2O 2.0 μl；PCR反應條件為95 ℃ 10 s預變性，95 ℃ 5 s、61 ℃ 30 s 共35個循環。擴增結束后獲得循環閾值(CT值)，Foxp3 mRNA的相對表達量采用2-ΔΔCT分析，ΔΔCt =實驗組ΔCt (目的基因Ct-內參基因Ct)-對照組ΔCt(目的基因Ct-內參基因Ct)。

3. 酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測血漿TGF-β1水平： 取5 μl血漿，采用TGF-β1 ELISA試劑盒檢測血漿中TGF-β1水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，每個樣本做3個復孔。

三、統計學分析

結果

一、特發性肺纖維化患者外周血CD4+Foxp3+Treg細胞百分率的比較

流式細胞術結果顯示特發性肺纖維化患者外周血CD4+Foxp3+Treg細胞百分率為(6.52±1.74)%，與正常對照組(9.76±2.17)%相比明顯降低，差異有統計學意義(t=7.129，P<0.001)，見圖1。

圖1特發性肺纖維化患者外周血CD4+Foxp3+Treg細胞百分率

二、特發性肺纖維化患者外周血Foxp3 mRNA及血漿TGF-β1水平的比較

熒光定量PCR結果顯示特發性肺纖維化患者Foxp3 mRNA表達水平較正常對照組明顯降低(P<0.001)；ELISA結果顯示特發性肺纖維化患者血漿TGF-β1水平明顯低于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.001)，見表1。

表1特發性肺纖維化患者外周血Foxp3 mRNA及

組 別例數Foxp3mRNATGF-β1(ng/L)正常對照組400.62±0.2738510±6724特發性肺纖維化組360.38±0.1629470±5837 t值4.6476.226 P值0.0000.000

討論

1986年Mosmann和Coffman等[19]首先根據小鼠CD4+T細胞分泌的細胞因子及功能不同，將Th細胞分為Th1和Th2細胞兩個亞群。隨后Sakaguchi等[20]于1995年首先報道了小鼠體內天然存在一類CD4+T細胞表面持續表達分化抗原CD25(IL-2受體α鏈)，將這群細胞去除后可以引起各種自身免疫性疾病的發生，證實這群細胞在體內和體外均具有免疫抑制作用，隨后在人外周血中也發現了該群細胞。2003年Hori等[18]研究證實Foxp3在CD4+CD25+Treg細胞的發育和功能維持中發揮重要作用，是該群細胞的一個特征性標志，目前普遍認為CD4+CD25+Treg細胞是一群有特異細胞膜表面分子和核轉錄因子并具有免疫抑制作用的T細胞亞群。研究證實CD4+CD25+Treg細胞具有免疫無能和免疫抑制兩大功能，免疫無能是指各種刺激原(如IL-2、抗CD3單抗)均能刺激CD4+CD25-T細胞的增殖，但CD4+CD25+Treg細胞對這些刺激表現為無反應(即無增殖性)，也不分泌IL-2。當經TCR介導信號刺激并有高濃度外源IL-2存在的情況下，CD4+CD25+Treg細胞可活化并增殖，但其增殖程度比CD4+CD25-T細胞弱的多。免疫抑制表現為CD4+CD25+Treg細胞在經TCR介導的信號刺激活化后能夠抑制CD4+和CD8+T細胞的活化和增殖。越來越多的研究證實Treg細胞在腫瘤、感染性疾病、移植免疫尤其是自身免疫性疾病中發揮了重要作用[7-8]。

特發性肺纖維化的發病機制尚未清楚，炎癥反應和自身免疫在其發病過程中的作用越來越受到重視。而Treg細胞在炎癥反應及維持自身免疫耐受中發揮重要作用，在多發性硬化癥、系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎等自身免疫性疾病中數量及功能異常。國內外學者通過實驗發現肺纖維化動物模型的肺組織及外周血中Treg細胞數量明顯降低，提示Treg細胞可能在肺纖維化發病過程中發揮了重要作用[9-15]。我們利用流式細胞術檢測了特發性肺纖維化患者外周血中CD4+Foxp3+Treg細胞百分率，結果發現特發性肺纖維化患者外周血CD4+Foxp3+Treg細胞百分率與正常對照組相比明顯降低，差異有統計學意義(P<0.001)，這與國外學者研究結果基本一致[21-22]。Foxp3是foxhead家族叉頭/翼狀螺旋結構(forkhead/winged-helix)成員，多個研究小組均證明Foxp3在CD4+CD25+Treg細胞上特異性表達在CD4+CD25+Treg細胞的發育和功能上是必需的[23-24]。本研究還檢測了特發性肺纖維化患者外周血中Foxp3 mRNA表達水平，結果顯示特發性肺纖維化患者Foxp3 mRNA表達水平較正常對照組明顯降低(P<0.001)，這與外周血中CD4+Foxp3+Treg細胞百分率結果一致，進一步證實了特發性肺纖維化患者外周血中CD4+Foxp3+Treg細胞百分率降低。Treg細胞發揮免疫抑制作用主要通過直接接觸抑制和分泌TGF-β1等免疫抑制因子，我們的實驗發現特發性肺纖維化患者血漿TGF-β1水平明顯低于正常對照組(P<0.001)，提示特發性肺纖維化患者體內的CD4+Foxp3+Treg細胞功能也可能存在異常。

綜上所述，特發性肺纖維化患者體內的CD4+Foxp3+Treg細胞數量和功能可能存在異常，CD4+Foxp3+Treg細胞在特發性肺纖維化發生、發展過程發揮一定作用，但導致CD4+Foxp3+Treg細胞異常的具體機制尚不明確。進一步研究Treg細胞在特發性肺纖維化中的作用，有可能為早期診斷及臨床治療特發性肺纖維化提供新的靶點。

參考文獻

1任成山, 錢桂生. 特發性間質性肺炎的現代概念及研究進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版, 2010, 3(4): 276-284.

2崔社懷. 特發性肺間質纖維化的回顧和展望[J/CD]. 中華肺部疾病雜志: 電子版, 2010, 3(1): 4-5.

3Kolb M, Collard HR. Staging of idiopathic pulmonary fibrosis: past,

present and future[J]. Eur Respir Rev, 2014, 23(132):220-224.

4Ryu JH, Moua T, Daniels CE, et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: evolving concepts[J]. Mayo Clin Proc, 2014, 89(8):1130-1142.

5Yang IV, Schwartz DA. Epigenetics of idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Transl Res, 2015, 165(1): 48-60.

6Wolters PJ, Collard HR, Jones KD. Pathogenesis of idiopathic pulmonary

fibrosis[J]. Annu Rev Pathol, 2014, 9: 157-179.

7Piccirillo CA. Regulatory T cells in health and disease[J]. Cytokine,

2008, 43(3): 395-401.

8Cools N, Ponsaerts P, van Tendeloo VF, et al. Regulatory T cells and human disease[J]. Clin Dev Immunol, 2007, 2007: 89195.

9Tang YJ, Xiao J, Huang XR, et al. Latent transforming growth factor-β1 protects against bleomycin-induced lung injury in mice[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2014, 51(6): 761-771.

10Szema AM, Reeder RJ, Harrington AD, et al. Iraq dust is respirable,

sharp, and metal-laden and induces lung inflammation with fibrosis in mice via IL-2 upregulation and depletion of regulatory T cells[J]. J Occup Environ Med, 2014, 56(3): 243-251.

11Lo Re S, Lecocq M, Uwambayinema F, et al. Platelet-derived growth

factor-producing CD4+Foxp3+regulatory T lymphocytes promote lung fibrosis[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2011, 184(11): 1270-1281.

12Liu F, Liu J, Weng D, et al. CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice[J]. PLoS One, 2010, 5(11): e15404.

13Trujillo G, Hartigan AJ, Hogaboam CM. T regulatory cells and attenuated

bleomycin-induced fibrosis in lungs of CCR7-/- mice[J]. Fibrogenesis Tissue Repair, 2010, 3: 18.

14賴小映, 鐘小寧. Th17、Treg 在肺纖維化小鼠外周血、肺組織中的表達及意義[J]. 山東醫藥, 2013, 53(19): 1-4.

15萬勇, 張念, 李劍平, 等. 調節性T細胞與Th17細胞的失衡及其對大鼠肺纖維化的影響[J]. 華中科技大學學報(醫學版), 2013, 42(2): 161-167.

16孫錦濤, 徐興祥. 特發性肺纖維化發病機制及藥物治療的研究進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志: 電子版, 2015, 8(2): 228-233.

17Galati D, De Martino M, Trotta A. Peripheral depletion of NK cells and imbalance of the Treg/Th17 axis in idiopathic pulmonary fibrosis patients[J]. Cytokine, 2014, 66(2): 119-126.

18Raghu G, Collard HR, Egan JJ, et al. An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement: idiopathic pulmonary fibrosis: evidence-based guidelines for diagnosis and management[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2011, 183(6): 788-824.

19Mosmann TR, Cherwinski H, Bond MW. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins[J].J Immunol, 1986, 136(7): 2348-2357.

20Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, et al. Immunologic self-tolerance

maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J]. J Immunol, 1995, 155(3): 1151-1164.

21Hori S, Nomura T, Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development

by the transcription factor Foxp3[J]. Science, 2003, 299(5609): 1057-1061.

22Kotsianidis I, Nakou E, Bouchliou I, et al. Global impairment of CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells in idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2009, 179 (12): 1121-1130.

23Marson A, Kretschmer K, Frampton GM, et al. Foxp3 occupancy and regulation of key target genes during T-cell stimulation[J]. Nature, 2007, 445(7130): 931-935.

24Fontenot JD, Gavin MA, Rudensky AY. Foxp3 programs the development

and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J]. Nat Immunol, 2003, 4(4): 330-336.

(本文編輯：張大春)

史紅陽，鄧文靜，張玉萍，等. 特發性肺纖維化患者外周血中CD4+Foxp3+調節性T細胞表達水平分析[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(6)： 694-697.

【摘要】目的探討特發性肺纖維化患者外周血中Foxp3+調節性T細胞(Treg)的表達水平。方法選取36例特發性肺纖維化患者和40例健康者作為對照，分別采用流式細胞術、RT-PCR和ELISA法檢測外周血CD4+Foxp3+Treg細胞百分率、核轉錄因子叉頭翼狀螺旋轉錄因子3(Foxp3)mRNA的表達以及血漿轉化生長因子-β1(TGF-β1)的水平。結果特發性肺纖維化患者外周血中CD4+Foxp3+Treg細胞百分率(6.52±1.74)% 、Foxp3 mRNA 表達水平(0.38±0.16)及血漿TGF-β1水平(29 470±5 837)ng/L與正常對照組[(9.76±2.17)%、0.62±0.27、(38 510±6 724)ng/L]相比明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。結論特發性肺纖維化患者外周血中CD4+Foxp3+Treg細胞數量和功能異常，可能與特發性肺纖維化的發生有關。

【關鍵詞】特發性肺纖維化；調節性T細胞；核轉錄因子；轉化生長因子-β1

Expression levels of CD4+Foxp3+regulatory T cells in the peripheral blood of patients with idiopathic pulmonary fibrosisShiHongyang,DengWenjing,ZhangYuping,ZhongYujie,LiuYun,FangPing,ZhangDexin.DepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondAffiliatedHospitalofMedicalCollege,Xi′anJiaoTongUniversity,Xi′an710004,China

Correspondingauthor：ShiHongyang,Email:shihy2003@126.com

【Abstract】ObjectiveTo explore the expression of CD4+Foxp3+regulatory T cells in the peripheral blood of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. MethodsA total of 36 patients with idiopathic pulmonary fibrosis and 40 normal controls were enrolled. The percentage of CD4+Foxp3+Treg cells, the mRNA level of foxhead winged-helix box protein 3 (Foxp3) and the levels of plasma transforming growth factor-β1 (TGF-β1) were detected by flow cytometry, real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). ResultsThe percentage of CD4+Foxp3+Treg cells [(6.52±1.74)%], the mRNA level of Foxp3 (0.38±0.16)and the plasma levels of TGF-β1 (29 470±5 837)ng/L in the peripheral blood of patients with idiopathic pulmonary fibrosis were statistically lower than those in normal controls [(9.76±2.17)%, 0.62±0.27, (38 510±6 724) ng/L](P<0.05). ConclusionsThe number and function of CD4+Foxp3+Treg cells in peripheral blood of patients with idiopathic pulmonary fibrosis were abnormal. CD4+Foxp3+Treg cells may participate in the pathology of idiopathic pulmonary fibrosis.

【Key words】Idiopathic pulmonary fibrosis;Regulatory T cells;Foxp3;Transforming growth factor-β1

(收稿日期：2015-11-06)

中圖法分類號：R563

文獻標識碼：A

通訊作者：史紅陽，Email: shihy2003@126.com

基金項目：中央高校基本科研業務費專項資金資助

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.06.005