三種化學小分子對補體旁路激活致內皮細胞黏附分子表達的干預及機制研究

李朝勝，孫黔云

（1．貴州大學藥學院，貴州貴陽 550025；2．貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽 550002）

三種化學小分子對補體旁路激活致內皮細胞黏附分子表達的干預及機制研究

李朝勝1，2，孫黔云2

（1．貴州大學藥學院，貴州貴陽 550025；2．貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽 550002）

中國圖書分類號：R322.12；R329.24；R392.11；R392.12；R977.6

摘要：目的 研究白藜蘆醇（Res）、PDTC和AG490 3種化學小分子對補體旁路激活致人微血管內皮細胞炎癥反應相關黏附分子表達的干預作用和可能的作用機制。方法 采用補體旁路激活產物作用于人微血管內皮細胞（HMEC）。TBA法檢測細胞培養上清中丙二醛（MDA）的濃度，ELISA方法檢測細胞培養上清中可溶性黏附分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的表達，并采用多個濃度的Res、NF-κB信號通路抑制劑PDTC和JAK2信號通路抑制劑AG490預處理內皮細胞，研究3種抑制劑對細胞氧化水平和黏附分子表達的干預作用。利用Western blot檢測補體旁路激活產物作用于內皮細胞對NF-κB p65磷酸化的影響及3種抑制劑的干預作用。結果 HMEC受補體旁路激活產物刺激后，導致細胞培養上清中MDA濃度升高，NF-κB p65磷酸化和黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的表達上調。Res可降低細胞培養上清中MDA的濃度。Res、PDTC和AG490能抑制NF-κB p65的磷酸化。Res與PDTC能抑制內皮細胞黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達，對E-selectin的表達有一定的抑制作用，而AG490能夠明顯抑制上述3種黏附分子的表達。結論 Res、PDTC和AG490對補體旁路激活產物致內皮細胞黏附分子表達上調有不同程度的抑制作用，其作用機制與NF-κB信號通路的活化有關，而JAK2可能是一個更重要的調控位點。

關鍵詞：補體；補體旁路激活；內皮細胞；黏附分子；白藜蘆醇；炎癥反應；眼鏡蛇毒因子

網絡出版時間：2015－9－14 14：53 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．038．html

內皮細胞作為血管內壁的屏障，與炎癥、心血管疾病、糖尿病、靜脈血栓形成和病毒感染性疾病的發生發展直接相關［1］。其中多種疾病的發生都伴隨有補體旁路的激活，激活的補體能夠導致內皮細胞活化，引起一系列結構和功能的改變，在諸如血管擴張、血管通透性增加、炎癥細胞黏附、遷移及趨化等過程中均發揮重要的作用［2］，并能影響纖溶和凝血功能［3－4］。其中黏附分子的表達是炎癥反應啟動和發展的一個重要環節。本文研究了Res、PDTC和AG490三種化學小分子對補體旁路激活致內皮細胞黏附分子表達的干預作用和可能的作用機制。

1　材料與方法

1．1材料 RPMI 1640培養基為美國Gibco公司產品，胎牛血清為天津灝洋生物產品；人ICAM-1、E-selectin、VCAM-1 ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；吡咯烷二硫氨基甲酸（pyrro-lidine dithiocarbamate，PDTC）、白藜蘆醇（resveratrol，Res）購自美國Sigma公司；AG490、兔抗人NF-κB p65單克隆抗體（93H1）、MDA檢測試劑盒為碧云天生物研究所產品；兔抗人β-actin單克隆抗體（13E5）購自美國CST公司；眼鏡蛇毒因子（cobra venom factor，CVF）由本實驗室制備提供，其分離純化和檢測方法參照文獻［5］進行；正常人血清（normal human serum，NHS）由本實驗室健康志愿者獻血制備，滅活人血清（inactive normal human serum，INHS）由正常人血清56℃滅活30 min制備。

1．2主要儀器 Forma 3111 CO2培養箱和Revco超低溫冰箱（美國Thermo公司）；Nikon TS100倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；Spectra MAX-190連續波長酶標儀（美國MD公司）；5810R冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Elix純水系統和Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）；DYCZ-24D型和DYCZ-4013型電泳槽（北京市六一儀器廠）。

1．3實驗方法

1．3．1細胞培養 人微血管內皮細胞株（HMEC）由本實驗室傳代培養，用含胎牛血清體積分數為0.2的RPMI 1640培養基于37℃培養箱進行培養，收集對數生長期的細胞進行實驗。

1．3．2 補體旁路激活產物的制備 參照文獻［6］方法，將CVF（6.5×104U·L－1）與NHS等比例進行混合，37℃水浴30 min，CVF激活產物（CVF-activated complement，CAC）根據需要于臨用時提前制備。實驗中以CVF與INHS混合制備的孵育物作對照。

1．3．3CAC對MDA濃度的影響 HMEC以1× 105cells每孔接種24孔培養板，培養24 h后去除細胞培養液，以溫育的無血清RPMI 1640培養基清洗1次，加入140 μL無血清RPMI 1640培養基和60 μL CAC孵育產物，分別于不同時間點取細胞培養上清，按試劑盒說明書檢測MDA。

1．3．4CAC對HMEC黏附分子表達的影響HMEC以1×104cells每孔接種96孔培養板，培養24 h后去除細胞培養液，加入140 μL溫育的無血清RPMI 1640培養基和60 μL CAC孵育產物，分別于不同時間點取細胞培養上清，按試劑盒說明書檢測E-selectin、ICAM-1和VCAM-1。

1．3．5Western blot檢測CAC對NF-κB p65磷酸化的作用 HMEC以5×105cells接種75 mL培養瓶，48 h后棄去培養基，加入CAC并以無血清RPMI 1640培養基補足至2 mL，于37℃培養箱中分別作用5 min、30 min和1 h。棄上清，在冰水浴中刮取細胞，提取細胞質蛋白，經BCA蛋白定量后以SDS-PAGE分離，轉至PVDF膜上，經一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h后，以DAB顯色試劑顯色后晾干拍照。照片以Image J作圖軟件進行灰度分析。

1．3．6Res對MDA的干預作用 HMEC以1×105cells每孔接種24孔培養板，培養24 h后去除細胞培養液，以溫育的無血清RPMI 1640培養基清洗1次，加入140 μL以無血清RPMI 1640培養基配制的Res，37℃預處理1 h后加入60 μl CAC，輕輕混勻后培養24 h，收集細胞培養液按試劑盒說明書檢測MDA。

1．3．7Res、PDTC和AG490對黏附分子表達的干預作用 HMEC以1×104cells每孔接種96孔培養板，培養24 h后去除細胞培養液，以溫育的無血清RPMI 1640培養基清洗1次，加入140 μL以無血清RPMI 1640培養基配制的Res、PDTC、AG490，37℃預處理1 h后加入60 μL CAC，輕輕混勻后分別作用不同時間，收集細胞培養液，按試劑盒說明書檢測E-selectin、ICAM-1和VCAM-1。

1．3．8Res、PDTC和AG490對NF-κB p65磷酸化的干預作用 HMEC以5×105cells接種75 mL培養瓶，48 h后棄去培養基，以溫育的無血清RPMI 1640培養基清洗1次，加入1 400 μL以無血清RP-MI 1640培養基配制的的Res（20 μmol·L－1）、PDTC（100 μmol·L－1）和AG490（100 μmol·L－1），37℃預處理1 h后，加入600 μL CAC，輕輕混勻后37℃作用30 min，于冰水浴中刮取細胞提取胞質蛋白，按前述方法進行Western blot檢測和灰度分析。1．3．9 統計學分析 實驗檢測數據以±s表示，以SPSS 19．0進行單因素方差分析。

2　結果

2．1CAC對內皮細胞MDA濃度的影響及Res的作用 CAC作用于內皮細胞，其細胞培養液中MDA濃度隨作用時間延長含量逐漸升高，在12 h時檢測到MDA濃度的升高（P＜0.05），24 h時差異更明顯（P＜0.01）。5 μmol·L－1的Res即可明顯降低MDA的濃度，與模型組相比差異具有顯著性（P＜0.01）（Fig 1）。

Fig 1 Effect of CAC on MDA concentration（n＝4）

2．2CAC對內皮細胞黏附分子表達的影響

2．2．1Res、PDTC和AG490對ICAM-1表達的作用CAC作用于內皮細胞導致ICAM-1的表達上調，在6 h時檢測到表達的高峰，與之前的結果類似［6］。不同濃度的Res、PDTC和AG490都能抑制ICAM-1的表達，其中10和20 μmol·L－1的Res、50和100 μmol·L－1的PDTC和20、50、100 μmol·L－1的AG490與模型組相比差異有顯著性（P＜0.01或P ＜0.05）（Fig 2）。

2．2．2Res、PDTC和AG490對VCAM-1表達的作用CAC作用于內皮細胞導致VCAM-1的表達上調，在6 h時檢測到表達的高峰（數據未列）。測試的不同濃度的Res PDTC和AG490都能明顯抑制VCAM-1的表達（P＜0.01）（Fig 3）。

2．2．3Res、PDTC和AG490對E-selectin表達的作用 CAC作用于內皮細胞導致E-selectin的表達上調，并在12 h時檢測到表達的高峰，與之前的結果類似［6］。Res和PDTC能在一定程度上抑制E-se-lectin的表達，而AG490能明顯抑制E-selectin的表達（P＜0.01）（Fig 4）。

Fig 2 Effect of Res，PDTC and AG490 on ICAM-1 expression induced by CAC for 6 h（n＝4）

Fig 3 Effect of Res，PDTC and AG490 on VCAM-1 expression induced by CAC for 6 h（n＝4）

Fig 4 Effect of Res，PDTC and AG490 on E-selectin expression induced by CAC for 12 h（n＝4）

2．3補體旁路激活對NF-κB p65磷酸化的作用CAC分別刺激HMEC 5、30和60 min，檢測到30 min組的NF-κB p65的磷酸化作用最明顯（Fig 5）。Res、PDTC和AG490對補體旁路激活產物引起的NF-κB p65磷酸化都表現出一定的抑制作用（Fig 6）。

Fig 5 NF-κB p65 phosphorylation in HMECS after

Fig 6 Effect of different inhibitors on inhibiting NF-κB p65 phosphorylation in HMECS after exposure to CAC for 30 min（n＝3）

3　討論

補體旁路激活在多種疾病的發生發展中扮演著重要角色，補體激活產物會導致內皮細胞形態和功能改變，引起多種細胞因子的表達變化。本研究在課題組前期工作的基礎上，采用CVF這一高度特異的補體替代途徑激活蛋白來激活補體旁路。CVF在血清環境中可與補體B因子特異性結合，形成CVF·B復合物，它能被補體D因子特異性地識別和酶切，進而形成CVF·Bb復合物。該復合物具有C3／C5轉化酶的活性，可以持續激活補體旁路途徑，產生C3a、C3b、C5a及攻膜復合物等一系列活化產物。這種補體旁路途徑的激活方式與體內病理生理條件下補體旁路途徑的過度激活高度一致［6］。

研究結果顯示，內皮細胞受到CAC刺激后會引起MDA濃度的持續升高，5 μmol·L－1的Res即能明顯抑制補體旁路激活產物引起的MDA水平增高。這表明，補體旁路激活產物刺激內皮細胞存在氧化應激的作用，而Res能有效抑制氧化應激，與文獻［7］報道的Res的抗氧化作用相吻合。

之前的研究表明，補體旁路激活會引起內皮細胞NF-κB、JAK2和p38 MAPK信號通路的活化［8］，導致黏附分子P-selectin、ICAM-1和E-selectin的表達上調［6］。本實驗采用能夠抑制NF-κB信號通路和氧化應激的Res、NF-κB信號通路特異性抑制劑PDTC和JAK2信號通路特異性抑制劑AG490對黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的表達進行干預。結果顯示，補體旁路激活產物刺激內皮細胞，引起NF-κB p65的磷酸化和內皮細胞可溶性黏附分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的蛋白表達上調。Res、PDTC和AG490都能抑制NF-κB p65的磷酸化，但對黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表達的作用結果不同。Res與PDTC的作用結果相似，都能抑制ICAM-1和VCAM-1的表達，但對E-se-lectin表達的抑制作用不明顯。這提示，NF-κB信號通路是補體旁路激活致黏附分子ICAM-1和VCAM-1表達的重要調控路徑，但E-selectin的表達與NF-κB的關聯度不高。AG490能明顯抑制上述三種黏附分子的表達上調，提示了JAK2在補體旁路激活致黏附分子表達中可能是一個更重要的干預靶點。

目前的研究表明，與炎癥相關的NF-κB、JAK2 和MAPK信號通路之間存在網絡交互性，同時氧化應激在炎癥相關黏附分子的表達中也扮演著重要角色，其中VCAM-1的表達與NADPH氧化酶的活化和ROS的增高密切相關［9－11］。之前的研究表明，補體旁路激活引起的黏附分子表達變化至少涉及NF-κB和JAK2通路的活化，PDTC和AG490合用時能

更明顯抑制ICAM-1的表達［8］。目前對Res的研究表明，Res能抑制NF-κB信號通路的活化和氧化應激，而氧化應激主要與NADPH氧化酶活性相關，對NADPH氧化酶活性的抑制能減少ROS的生成［7］，同時ROS又能刺激NF-κB的活化，這兩種作用在Res抑制補體旁路激活致內皮細胞黏附分子的表達過程中是否同步存在尚需進一步驗證。而Western blot的檢測結果提示，AG490對JAK2的抑制也導致了對NF-κB p65磷酸化的抑制，JAK2可能是補體旁路激活致內皮細胞炎癥反應中NF-κB和JAK2所組成的調控網絡中的一個上游調控位點。

本研究表明，Res、PDTC和AG490三種化學小分子對補體旁路激活致內皮細胞黏附分子表達上調有不同程度的抑制作用，其作用機制與NF-κB信號通路的活化有關，而JAK2可能是一個更重要的調控位點。本研究為進一步闡明補體旁路激活致內皮細胞炎癥反應相關信號通路的調控機制和潛在的作用靶點提供線索，同時也為Res的開發應用提供參考依據。

（致謝：本文實驗是在貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室藥理與活性篩選中心孫黔云研究員課題組的實驗室完成。）

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Effect of three chemical molecules on adhesion molecules expression in HMECs induced by activated complement alternative pathway

LI Chao-sheng1，2，SUN Qian-yun2
（1．Dept of Pharmacology，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2．The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products，Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550002，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of resveratrol （Res），PDTC and AG490 on adhesion molecules ex-pression induced by product of activated complement alternative pathway on human microvascular endothelial cells（HMECs）and the possible mechanisms．Meth- ods HMECs were exposed to the product of comple-ment alternative pathway activation，then the superna-tant was removed to detect the concentration of malond-ialdehyde（MDA）with TBA method．ELISA method was used to detect the expression of soluble ICAM-1，

VCAM-1（and E-selectin）in the culture supernatant．Res，PDTC and AG490 with different concentrations were used to determine their effect on cell oxidation level and adhesion molecules expression．The phospho-rylation of NF-κB p65 was detected by Western blot，and the intervention of Res，PDTC and AG490 was as-sayed by the same way．Results The activation of complements alternative pathway resulted in the phos-phorylation of NF-κB p65，and increased the concen-tration of MDA and up-regulated the expression of ICAM-1，VCAM-1 and E-selectin．Res reduced the concentration of MDA．Res，PDTC and AG490 inhibi-ted the phosphorylation of NF-κB p65．Res and PDTC showed similar inhibition on expression of ICAM-1 and VCAM-1，while exhibiting little effect on expression of E-selectin，and AG490 significantly inhibited the ex-pression of the above adhesion molecules．Conclusions Res，PDTC and AG490 could inhibit the expression of adhesion molecules induced by activated complement alternative pathway，the inhibition of NF-κB pathway activation was involved in their mechanism，and JAK2 may be a more important intervention target in regula-ting adhesion molecule expression．

Key words：complement；complement alternative path-way（activation）；endothelial cell；adhesion molecule；resveratrol；inflammation；cobra venom factor

作者簡介：李朝勝（1988－），男，碩士生，研究方向：天然藥物成分及生理活性，E-mail：lics＿1988＠163．com；孫黔云（1968－），男，博士，研究員，碩士生導師，研究方向：生化藥理與新藥發現，通訊作者，Tel：0851-83805095，Fax：0851-83805081，E-mail：sunqy＠hotmail．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 31060124）；貴州省優秀科技教育人才省長專項資金資助項目［黔省專合字（2012）9號］

收稿日期：2015－06－08，修回日期：2015－07－06

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1421－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．019