苦蕎黃酮轉運相關蛋白基因FtAH4L的克隆及表達分析

趙經昊，李成磊，姚慧鵬，陳 惠，趙海霞，吳 琦

（四川農業大學生命科學學院，四川雅安625014）

苦蕎黃酮轉運相關蛋白基因FtAH4L的克隆及表達分析

趙經昊，李成磊，姚慧鵬，陳 惠，趙海霞＊，吳 琦

（四川農業大學生命科學學院，四川雅安625014）

為研究苦蕎黃酮轉運相關基因，以苦蕎（Fagopyrum tataricum）品種“西蕎二號”為材料，克隆到1條質膜H＋－ATPase基因（autoinhibited H＋－ATPase isoform4 like，AH4L），將其命名為FtAH4L。通過開放閱讀框（ORF）分析，FtAH4L基因cDNA全長3 398bp，開放閱讀框2 898bp，編碼966個氨基酸殘基，理論分子量為109 kD，等電點6.48。氨基酸保守基序比對分析表明，AH4L在植物種間較為保守。在茉莉素誘導處理和5種光（白色熒光、LED白光、LED藍光、LED紅光和UV－B）處理芽期苦蕎后，采用半定量RT－PCR和AlCl3比色法分析結果表明，茉莉素處理后的苦蕎胚軸和子葉中FtAH4L基因表達量與黃酮含量均顯著上升，且二者呈正相關關系；5種光對子葉中FtAH4L表達量無顯著影響，但均顯著增加其黃酮含量；胚軸中，除LED紅光外，各種光均顯著提高FtAH4L表達量和總黃酮含量，且LED藍光與UV－B的影響極顯著。該研究結果為深入研究FtAH4L基因參與苦蕎黃酮轉運奠定了基礎。

苦蕎；質膜H＋－ATPase基因；基因表達；黃酮含量

黃酮化合物是植物中一大類重要的次生代謝產物，由細胞質多酶復合體合成后，可在位于生物膜上的各類轉運蛋白幫助下進行胞內跨膜或長距離運輸［1］。現已了解的黃酮轉運主要依賴以下3種類型：ABC－Type類型的轉運體（ATP binding cassette－Type transporters）［2］，MATE型轉運體（MATE－Type transporters）［3］和質子依賴型轉運（proton－dependent transporters）［4］。其中，質膜H＋－ATPase類蛋白通過建立的跨膜質子電動勢，帶動其它次級運輸體參與原花青素和黃酮醇的運輸［5］。H＋－ATPase是植物細胞的“主宰酶”，由它建立的跨膜質子電動勢是物質跨膜運送的原初動力。近年研究發現，干旱、低溫、鹽漬和射線輻照等逆境都影響H＋－ATPase的活力，并認為該酶活力的變化是植物傷害的原初位點［5］，質子依賴型轉運體按亞細胞定位的結果大致分為定位于細胞質膜的P－type H＋－ATPase，以及細胞內膜上的V－type H＋－ATPase和焦磷酸酶（PPase）3種，其中P－type H＋－ATPase參與了逆境脅迫下生物膜上的反應［6］。AHA10（Arabidopsis thaliana autoinhibited H＋－ATPase isoform 10）是擬南芥（Arabidopsis thaliana）中P－type ATPase家族的一員，AHA10基因的缺失導致花青素在相應的突變體的種皮中不能積累，說明定位于細胞內膜系統的P－type H＋－ATPase與植物黃酮轉運存在著相關性［7］。

苦蕎（Fagopyrum tataricum）為食藥兩用植物，含有豐富的黃酮類化合物［8］，對人體具有降脂、降糖和抗氧化等藥理作用和生理功能［9］。以蘆丁為代表的黃酮，主要在苦蕎萌發階段的子葉（5%～6%）［10］和花期的花蕾（6.0%～6.5%）［11］中積累，參與抵抗UV－B輻射、抗寒、抗旱等生理過程［12－14］，無論是正常生長或受到環境脅迫，子葉中的黃酮含量均高于胚軸，但二者黃酮合成相關基因表達水平卻并不如此，即不同組織器官黃酮含量與黃酮相關合成酶基因表達水平并非線性相關，提示在苦蕎中存在黃酮跨膜運輸機制［15］。本研究以高黃酮苦蕎栽培種“西蕎2號”為材料，克隆其H＋－ATPase基因的cDNA，分析在茉莉素和不同光處理后，芽期苦蕎子葉和胚軸中H＋－ATPase基因的表達與總黃酮含量，研究該酶在苦蕎黃酮轉運中的分子調控機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及處理

“西蕎二號”苦蕎種子購自西昌學院，種植于四川農業大學生命科學學院實驗田，在花期取新鮮幼嫩葉片提取RNA，用于FtAH4L基因的克隆。

2013年11月，參照趙海霞等［16］的方法萌發苦蕎種子。將苦蕎種子置于40℃蒸餾水中浸泡30 min，均勻鋪在蓋有濾紙的培養皿中并保持濾紙濕潤，25℃暗室萌發。種子萌發2d后，選長度為1 cm的苦蕎芽，移植在新培養皿中并覆蓋1cm厚細砂。于光照培養箱光照條件下25℃培養14h，黑暗條件下18℃培養10h，并保持相對濕度60%。

參照楊文杰等［17］和Suzuki等［18］的方法，選取萌發8d長勢相近的芽期苦蕎為材料，將終濃度為100μmol／L的茉莉素（jasmonates，JAs）水溶液每30min均勻噴灑1次，分別收集處理0、2、4、6、8和10h后的子葉和胚軸備用。選取萌發6d長勢相近的芽期苦蕎為材料，在以下光照條件下分別進行培養：黑暗培養；強度為0.1MW／cm2的UV－B（385nm）照射；白色熒光（F）、LED白光（W）、LED紅光（R）和LED藍光（B）照射，光強保持在（50±5）μmol·m－2·s－1；光照12h／d，連續處理3d后，分別收集子葉和胚軸備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦蕎葉片總RNA提取和cDNA第一鏈制備

稱取苦蕎新鮮葉片2.0g，以植物RNAout試劑盒提取總RNA，電泳檢測其完整性。采用逆轉錄試劑盒（RevertAidTMFirststrand cDNA Synthesis Kit）將總RNA逆轉錄獲得cDNA模板，分裝后置于－80℃保存。

1.2.2 苦蕎H＋－ATPase基因的克隆 根據NCBI中擬南芥及其他被子植物的質膜H＋－ATPase基因AHA10（AT1G17260）的同源比對結果，設計簡并引物AHAjb－f和AHAjb－r（表1），以cDNA為模板，使用高保真DNA聚合酶pfu進行PCR擴增獲得苦蕎H＋－ATPase基因保守序列片段。反應參數為：94℃預變性4min；94℃變性50s，58℃退火45 s，72℃延伸1.5min，30個循環；72℃繼續延伸10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，回收清晰條帶加A尾經T載體克隆，篩選陽性轉化子送上海立菲生物技術有限公司測序。根據測序結果，設計特異引物ftAH5－1、ftAH5－2進行5′－RACE，使用特異引物ftAH3－1、ftAH3－2和ftAHN3－3進行3′－RACE。根據5′－RACE和3′－RACE測序結果拼接獲得苦蕎H＋－ATPase基因全長cDNA序列，設計特異引物ftAH4L－f和ftAH4L－r擴增其ORF序列。

1.2.3 生物信息學分析 采用DNAman（Version5.22）將得到的核苷酸序列推導為氨基酸序列，采用NCBI數據庫的Blast－p（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）進行同源比對，采用Clustal X（1.8）進行基于氨基酸序列的多重序列比對，SOPMA（http：／／npsa－pbil.ibcp.fr／cgi－bin／npsa＿automat.pl？page＝／NPSA／npsa＿seccons.html）進行二級結構分析，結合PSIPRED（http：／／bioinf.cs.ucl.ac.uk／）預測蛋白質跨膜區，采用SWISSMODEL（http：／／beta.swissmodel.expasy.org／）數據庫進行三維同源建模，采用MEGA6.0構建系統發育樹。

1.2.4 FtAH4L表達量分析和總黃酮測定 參照吳琦等［19］的方法采用半定量RT－PCR（semi－quantitative RT－PCR），使用引物ftAHAs－f和ftAHAs－r檢測FtAH4L在苦蕎子葉和胚軸中的表達量，以引物ft H3sm－f和ft H3sm－f檢測持家基因H3的表達量為內參（表1）。利用凝膠成像系統掃描電泳結果，以FtAH4L與H3的光密度值比值（optical intensity of FtAH4L／optical intensity of FtH3）來表示FtAH4L相對表達量。

采用AlCl3法［18］測定總黃酮，在420nm波長下測定吸光度，繪制標準曲線，擬合回歸方程，并計算相關系數。苦蕎子葉和胚軸樣品冷凍干燥置至恒重，研磨樣品至粉末，精確稱量0.100g樣品至10 mL離心管中，加入3mL 65%乙醇并使用封口膜密封。使用超聲波細胞破碎儀，以15%的輸出功率超聲20min提取總黃酮。12 000r／min離心5min后轉移上清至另一離心管中，再次加入2mL 65%乙醇，繼續超聲10min。12 000r／min離心5min后轉移并合并上清，使用等體積石油醚萃取排除葉綠素干擾，反復萃取至石油醚為無色透明后，使用分液漏斗分離并收集下層液體并使用0.45μm有機相濾膜過濾，所得樣品即為苦蕎總黃酮提取液。測定樣品OD420，對照標準曲線求得苦蕎組織中總黃酮含量（%）。

1.2.5 數據的分析和處理 用SPSS19.0軟件進行Duncan多重比較及顯著性檢驗，同時進行雙變量Pearson相關性分析。

2 結果與分析

2.1 苦蕎H＋－ATPase基因的克隆

使用簡并引物AHAjb－f和AHAjb－r擴增H＋－ATPase基因保守片段，獲得1條長度約為750bp的特異片段（圖1，A）。測序結果表明，該片段長813bp，與其他植物H＋－ATPase具有77%～84%的同源性。使用特異引物ftAH5－1和ftAH5－2進行5′－RACE，得到1條長約750bp的特異條帶（圖1，B）。使用特異引物ft AH3－1、ft AH 3－2和ftAHN3－3進行3′－RACE，得到1條約1 800bp的特異條帶（圖1，C）。將保守片段序列與5′－RACE和3′－RACE測序數據進行拼接，根據拼接結果設計的特異引物ftAH4L－f和ftAH4L－r擴增苦蕎H＋－ATPase基因ORF，獲得1條約3000bp的特異條帶（圖1，D）。序列分析表明，苦蕎ATPase基因的cDNA序列全長3 398bp，其ORF為2 898 bp，5′－UTR為170bp，3′－UTR為331bp并包含25 bp的Poly A尾，將該基因命名為FtAH4L，Gen－Bank登錄號為KF955601。

2.2 苦蕎FtAH4L的序列分析與系統發育樹

2.2.1 苦蕎FtAH4L序列分析 DNAman分析表明，FtAH4L基因編碼1個966氨基酸殘基的蛋白FtAH4L，分子量109kD，等電點6.48。BlastP同源比對表明，該序列與其他植物FtAH4L蛋白一致率在97%以上。選取雙子葉植物擬南芥、單子葉植物玉米（Zea mays）和人類（Homosapiens）的質膜P－typeATPase蛋白與FtAH4L氨基酸序列進行序列多重比對，表明其含有ATPase特異的基序：磷酸酯酶膜轉導區TGE基序、磷酸化作用區DKTGT基序、連接ATP結合區與參加陽離子結合和轉導跨膜區保守功能域MXGDGXNDXP結構（圖2）。SPOMA分析表明，FtAH4L二級結構中含有10個α螺旋組成的跨膜區，10個α螺旋與4個β片層加上一些無規則卷曲組成了該蛋白包含底物結合位點在內的活性中心。三維同源建模結果表明（圖3），FtAH4L蛋白的三維結構與Swiss－Model蛋白質數據庫中擬南芥auto－inhibited H＋－ATPase 2（AHA2）相似度最高，具備典型的P－type H＋－ATPase特征。FtAH4L的三維結構主要由跨膜區結構區（transmembrane domain）與細胞質功能域（cytoplasmic domain）即ATP結合功能域（ATP binding domain，ATP－BD）組成。前者為質子進出的通道，后者則由大小2個細胞質環組成。小的細胞質環有2個螺旋，為能量傳動區A（actuator domain，A－domain），控制陽離子的結合與釋放；大的細胞質環包括了磷酸化功能域P（phosphorylation domain，P－domain）和核酸結合區N（nucleotide binding domain，N－domain）。預測結果表明FtAH4L屬于典型的質膜P－typeATPase蛋白。

2.2.2 FtAH4L系統進化樹分析 選取GenBank數據庫中被子植物P－type H＋－ATPase的蛋白序列，采取MEGA6軟件的鄰接法重復10000次構建基于氨基酸序列的系統進化樹（圖4）。結果表明，該系統進化樹可以分為3個簇。其中ClusterⅢ主要由單子葉植物的P－type H＋－ATPase組成，FtAH4L被聚類至ClusterⅢ，并顯示與玉米的親緣關系最近。ClusterⅠ包含了大部分雙子葉植物的P－type ATPase，ClusterⅡ由包括擬南芥在內的3種雙子葉植物所組成。

2.3 茉莉素對苦蕎FtAH4L表達及黃酮含量的影響

芽期苦蕎經茉莉素連續處理10h，FtAH4L的表達量分析表明（圖5，A），處理后FtAH4L表達量比對照（0h）均極顯著提高（P＜0.01）。子葉中，FtAH4L表達對茉莉素誘導應答強烈，處理僅2h后其表達量就超過對照的2.5倍，相對表達量達到302%，然后下降至6h的193%，隨后迅速上升并穩定在300%左右。胚軸中，處理2h后，FtAH4L表達量上升至對照的近1.3倍，相對表達量的296%，并于6h達到最高（370%），隨后下降至10h的300%。黃酮含量測定表明（圖5，B），茉莉素誘導下，芽期苦蕎子葉和胚軸中黃酮含量均表現為隨時間逐步升高，并于10h達到最大值，子葉中黃酮含量為誘導前的1.3倍（P＜0.01），胚軸中則為處理前的15倍（P＜0.01）。相關分析表明，芽期苦蕎子葉與胚軸FtAH4L表達量與黃酮含量均呈正相關，子葉和胚軸中的相關系數分別為0.655和0.678。

2.4 光照對苦蕎FtAH4L表達及黃酮含量的影響

以黑暗為對照，采用白色熒光、LED白光、LED紅光、LED藍光和UV－B光照處理芽期苦蕎，FtAH4L表達量分析表明（圖6，A）：胚軸中，FtAH4L表達量僅在LED紅光組顯著降低（P＜0.05），為對照組的94%，在其他光照下都顯著升高，其中在LED藍光和UV－B組為極顯著增加（P＜0.01），相對表達量達到307%和354%。子葉中，FtAH4L表達量在所有光處理組均無顯著變化。FtAH4L在胚軸中的表達量都顯著高于子葉，表明其表達具有組織特異性。黃酮含量測定表明（圖6，B），所有光照組胚軸與子葉黃酮含量均顯著上升。其中，LED藍光和UV－B組呈極顯著升高，子葉黃酮含量為對照的1.4倍和2.0倍，胚軸黃酮含量則高達對照的2.7倍和5.9倍。可見，各種光照下苦蕎子葉FtAH4L表達量與黃酮含量無明顯相關，但胚軸FtAH4L表達量與黃酮含量具有正相關性。

3 討 論

已有研究表明，在正常生理條件［16］或在各種處理條件下［25］，苦蕎胚軸中黃酮合成途徑相關酶基因表達量無論比子葉中高還是低，其黃酮含量均顯著低于子葉，這可能與黃酮在苦蕎中的累積特點相關，即苦蕎胚軸中合成的黃酮可被轉運到子葉［26］。本研究中，在茉莉素和各種光處理芽期苦蕎前后，胚軸FtAH4L表達量均不同程度高于子葉，但子葉黃酮含量均顯著高于胚軸（P＜0.05），也支持上述觀點。此外，在苦蕎胚軸中，FtAH4L基因的表達不僅對茉莉素，而且對藍光和紫外光均具有強烈的響應；而在苦蕎子葉中，FtAH4L基因的表達僅對茉莉素具有強烈的響應。該現象提示，苦蕎胚軸與子葉中可能存在兩套不同的非生物脅迫響應機制，進而導致其黃酮積累過程和機制的差異。

目前，盡管對于植物黃酮胞內轉運、跨膜轉運及其調控機制的了解甚為有限，但隨著基因組共表達微陣列分析和突變體等分子遺傳學分析的深入，將有助于揭示膜轉運蛋白在代謝流調控中的重要作用［27］。本研究擬進一步分析苦蕎在各種逆境脅迫條件下，FtAH4L基因表達模式及與各種黃酮化合物含量和組織分布規律，以加深對苦蕎黃酮胚軸和子葉黃酮轉運和積累機制的理解。

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（編輯：宋亞珍）

Cloning and Expression Analysis of Flavonoids Transporter Gene FtAH4LfromFagopyrum tataricum

ZHAO Jinghao，LI Chenglei，YAO Huipeng，CHEN Hui，ZHAO Haixia＊，WU Qi
（College of Life Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an，Sichuan 625014，China）

The gene FtAH4L，which encoding the autoinhibited H＋－ATPase isoform 4like（AH4L）involved into flavonoids transportation，was cloned from tartary buckwheat cultivar Xiqiao No.2（Fagopyrum tatarium）.The length of FtAH4Lgene was 3 398bp，and the ORF（Open Reading Frame）was 2 898bp encoding 966amino acids.The molecular weight of FtAH4Lwas 109kD，and its pI was 6.48.Conserved motifs and phylogenetic analysis demonstrated that AH4Ls are relatively conservative in different plant species.At the seedling stage of tartary buckwheat，semi－quantitative RT－PCR analyzed the expression profiles of FtAH4Lgene，and AlCl3colorimetric method measured the total flavonoids content in cotyledons and hypocotyls，after jasmonates treatment and different lighting（White fluorescent，LED White，LED Blue，LED Red and UV－B）.The results showed that FtAH4Lexpression and flavonoids content not only had a significant increase（P＜0.05），but also showed a positive correlation in cotyledons and hypocotyls after jasmonates treatment.Under all the lightings，FtAH4Lexpression was unremarkable change（P＞0.05）while flavonoids content was raised obviously in cotyledons.However，in hypocotyls，FtAH4Lexpression and flavonoids content were promoted notably（P＜0.05）except LED Red.Particularly，LED blue and UV－B presented the extremely significant affect（P＜0.01）.This work could provide an important reference to understand the mechanism of FtAH4Lgene involved in flavonoids transportation in tartary buckwheat.

Fagopyrum tataricum；plasma membrane H＋－ATPase gene；gene expression；flavonoids content

Q785；Q786

A

1000－4025（2015）08－1511－07

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1511

2015－04－12；修改稿收到日期：2015－06－23

四川省教育廳青年基金（14ZB0008）

趙經昊（1988－），男，在讀碩士研究生，主要從事植物分子生物學研究。E－mail：ayanami＿rei2＠163.com

＊通信作者：趙海霞，副研究員，主要從事資源植物分子生物學研究。E－mail：zhaohaixia197708＠163.com