瀕危物種珊瑚菜遺傳多樣性的ISSR分析

王愛蘭，王貴琳，李維衛(wèi)

（1魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264025；2魯東大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部，山東煙臺(tái)264025）

瀕危物種珊瑚菜遺傳多樣性的ISSR分析

王愛蘭1，王貴琳1，李維衛(wèi)2＊

（1魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264025；2魯東大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部，山東煙臺(tái)264025）

該研究采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)中國(guó)10個(gè)居群的241個(gè)珊瑚菜樣本進(jìn)行了遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示：8條引物共檢測(cè)到76條清晰譜帶，其中多樣性條帶64條；POPGENE分析顯示，其物種水平多樣性條帶百分率（PPB）為84.21%，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.562 8，Shannon多樣性指數(shù)（I＊）為0.866 3，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)（h＊）為0.342 5，居群間的遺傳分化系數(shù)（GST）為0.205，基因流（Nm）為1.939 1，表明野生珊瑚菜具有較高的遺傳多樣性，且大部分遺傳多樣性存在于居群內(nèi)；AMOVA分析顯示，珊瑚菜居群間遺傳分化水平（FST）為0.259 1，也表明珊瑚菜居群內(nèi)變異大于居群間變異。研究認(rèn)為，珊瑚菜的瀕危原因主要來源于野生生態(tài)環(huán)境的破壞，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)種質(zhì)資源的保護(hù)。

珊瑚菜；ISSR；遺傳多樣性；基因流

珊瑚菜（Glehnia littoralis）屬于傘形科（Apiaceae）珊瑚菜屬（Glehnia）多年生二倍體（2n＝22），草本藥用植物，其繁殖方式為有性生殖，傳粉媒介以蟲媒和風(fēng)媒（非自花授粉）為主［1］。珊瑚菜屬僅有珊瑚菜一個(gè)種，主要分布在2個(gè)區(qū)域：其一是東亞珊瑚菜分布區(qū)，主要分布在東亞地區(qū)的中國(guó)、韓國(guó)、朝鮮、日本等4個(gè)國(guó)家海岸線的沙灘；其二是北美珊瑚菜分布區(qū)，主要分布在美國(guó)近海沙灘。中國(guó)境內(nèi)主要分布在遼寧、山東、江蘇、浙江、臺(tái)灣、福建、廣東和海南省沿海海岸［2］。珊瑚菜主要生長(zhǎng)在原始海灘的沙地里，特殊的沙土生境導(dǎo)致其根系非常發(fā)達(dá)，且根部膨大形成根狀莖，從而使其成為海岸固沙的良好經(jīng)濟(jì)品種。此外，珊瑚菜的膨大根莖被稱作北沙參，是一種傳統(tǒng)的中藥材，對(duì)免疫類疾病具有良好的療效，在中國(guó)已經(jīng)有600多年的使用歷史［3］。

由于珊瑚菜具有重要的藥用價(jià)值、種質(zhì)資源價(jià)值、經(jīng)濟(jì)及生態(tài)價(jià)值，在過去的幾十年里，野生珊瑚菜居群不僅受到來自生境退化甚至喪失的巨大壓力，也受到濫采濫挖的嚴(yán)重威脅，居群面積不斷縮小，居群數(shù)量迅速降低，對(duì)居群的繁衍和遺傳多樣性的維持造成困難，已被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)瀕危保護(hù)物種［4］，又被稱做植物界的大熊貓。

植物遺傳多樣性評(píng)估是研究瀕危物種保護(hù)機(jī)制的重要手段。雖然珊瑚菜屬物種已瀕臨滅絕，但是其種群遺傳多樣性的相關(guān)研究卻不多見，僅見利用等位酶標(biāo)記和SRAP分子標(biāo)記的相關(guān)研究報(bào)道［5－7］，對(duì)其遺傳結(jié)構(gòu)及其保護(hù)方面的研究還不夠深入。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列間多態(tài)性標(biāo)記（inter－simple sequence repeat，ISSR）為顯性遺傳標(biāo)記，由于其結(jié)合了RAPD和SSR的優(yōu)點(diǎn)，可以揭示出更多的多態(tài)性，且被證明具有較好穩(wěn)定性、可重復(fù)性、通用性和價(jià)格低廉的特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化和遺傳資源評(píng)價(jià)等方面［8－11］。為了進(jìn)一步深入研究珊瑚菜的遺傳多樣性，本研究采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)中國(guó)10個(gè)野生珊瑚菜居群的遺傳變異進(jìn)行分析，揭示其遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究選取中國(guó)境內(nèi)分布的10個(gè)居群，共241個(gè)珊瑚菜樣本，均為野外隨機(jī)采集的珊瑚菜幼嫩葉片，利用硅膠干燥保存，具體樣本編號(hào)與取樣地基本信息見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物篩選與PCR擴(kuò)增 本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的CTAB法［12］提取珊瑚菜基因組DNA，用1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，根據(jù)條帶亮度和有無拖尾情況，粗略估計(jì)該樣品DNA提取的質(zhì)量和濃度。將檢測(cè)合格的DNA（濃度比較大的DNA用超純水稀釋至約20ng／μL），置于－20℃冰箱中備用。

根據(jù)加拿大British Columbia大學(xué)公布的引物序列［13］，從中選取了30對(duì)進(jìn)行合成（北京華大基因）。在所有DNA樣本掃描之前，首先從珊瑚菜10個(gè)居群中隨機(jī)抽取少部分DNA樣品，進(jìn)行引物多態(tài)性和穩(wěn)定性的前期檢測(cè)，從中篩選出穩(wěn)定性好且條帶清晰的8個(gè)引物，用于群體的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為15μL，其中含1.5μL 10×Taq Buffer，0.5 mmol／L dNTPs，0～1.5mmol／L Mg2＋，5μmol／L ISSR引物，1UTaq酶，約30ng模板DNA。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min，94℃變性50s，50～55℃復(fù)性50s，72℃延伸75s，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸8min。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 按照清晰易辨、重復(fù)、穩(wěn)定的原則對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，同一位置有條帶的記為“1”、沒有條帶的記為“0”，以此形成0，1二元數(shù)據(jù)矩陣。利用POPGENE1.32軟件分析計(jì)算多樣性條帶百分率（PPB）、Shannon多樣性指數(shù)（I＊）、Nei’s多樣性指數(shù)（h＊）、遺傳分化系數(shù)（GST）等［14］；利用ARLEQUIN軟件中的AMOVA功能分析居群的遺傳分化水平（FST）［15］；采用NTSYS軟件對(duì)居群進(jìn)行UPGMA聚類分析；采用TFPGA進(jìn)行Mantel檢測(cè)，測(cè)定地理分布范圍與遺傳距離的相關(guān)關(guān)系［16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 珊瑚菜遺傳多樣性分析

利用8個(gè)ISSR引物對(duì)來自10個(gè)居群的241個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，共得到76條清晰的譜帶（部分結(jié)果見圖1），其中多樣性條帶64條，占總擴(kuò)增條帶的84.21%（表2）。通過POPGENE軟件分析，得到不同分布區(qū)珊瑚菜居群的平均遺傳多樣性水平，PPB為84.21%，Ne為1.562 8，I＊為0.866 3，h＊為0.342 5。根據(jù)I＊、h＊以及有效等位基因數(shù)，可知珊瑚菜10個(gè)自然居群的遺傳多樣性大小依次為：山東海陽＞山東日照＞遼寧長(zhǎng)海Ⅱ＞遼寧瓦房店＞河北秦皇島＞遼寧長(zhǎng)海I＞浙江舟山＞遼寧興城＞遼寧莊河＞遼寧鲅魚圈。其中，山東海陽（SDHY）居群的遺傳多樣性水平最高（Ne＝1.444 1，I＊＝0.882 5，h＊＝0.279 5）；遼寧鲅魚圈（LNBYQ）居群的遺傳多樣性水平最低（Ne＝1.260 7，I＊＝0.373 4，h＊＝0.154 2）。

2.2 珊瑚菜居群間遺傳變異分析

AMOVA分析顯示，珊瑚菜各居群間遺傳分化不明顯，居群間遺傳分化水平（FST）為0.259 1，即居群內(nèi)的遺傳分化水平為0.740 9，表明居群內(nèi)遺傳變異高于居群間的遺傳變異，且變異達(dá)到極顯著水平（P＜0.001）。POPGENE分析結(jié)果表明，居群間平均遺傳分化系數(shù)（GST）為0.205 0，表明79.5%的基因變異存在于居群內(nèi)。由此可見，AMOVA和POPGENE的分析結(jié)果是一致的。居群間基因流水平（Nm）為1.939 1，大于1，表明居群間有一定的基因交流。

2.3 珊瑚菜居群間的遺傳距離及遺傳一致度分析

根據(jù)POPGENE計(jì)算的Nei＇s［17］無偏離遺傳一致度和遺傳距離結(jié)果（表3）可知，珊瑚菜10個(gè)居群間的遺傳距離介于0.032 5～0.242之間，山東海陽（SDHY）居群與遼寧鲅魚圈（LNBYQ）居群的遺傳距離最大，為0.242；遼寧長(zhǎng)海I（LNCHI）居群與遼寧瓦房店（LNWFD）居群遺傳距離最小，為0.032 5。10個(gè)居群的遺傳一致度介于0.785 1～0.968 0之間，遼寧瓦房店（LNWFD）居群與遼寧長(zhǎng)海I（LNCHI）居群之間的遺傳一致度最大，為0.968 0，說明這2個(gè)居群的遺傳分化最小。遼寧鲅魚圈（LNBYQ）居群與山東海陽（SDHY）居群的遺傳一致度最小，為0.7851，說明這2個(gè)居群的遺傳分化相對(duì)來說最高。總體來說，10個(gè)居群的遺傳一致度都在0.78以上，說明所有居群之間的遺傳分化整體比較低，這也印證了本研究2.2所分析的遺傳變異主要存在于居群內(nèi)而非居群間。利用Mantel檢測(cè)分析了珊瑚菜10個(gè)居群遺傳距離與地理距離的相關(guān)性，結(jié)果表明居群間遺傳距離與地理距離不存在顯著的相關(guān)性（r＝－0.133 6，P＞0.05）。

2.4 聚類分析

UPGMA聚類分析結(jié)果（圖2）表明，珊瑚菜居群主要分為兩大分支，其中山東海陽、河北秦皇島、遼寧長(zhǎng)海Ⅱ，遼寧長(zhǎng)海I、遼寧瓦房店、遼寧莊河、遼寧興城聚為一支，該支又細(xì)分為2個(gè)小分支：山東海陽、河北秦皇島、遼寧長(zhǎng)海Ⅱ?yàn)橐粋€(gè)小分支，遼寧長(zhǎng)海I、遼寧瓦房店、遼寧莊河、遼寧興城為一個(gè)小分支；遼寧鲅魚圈、浙江舟山、山東日照聚為一支。總體來看，居群間的親緣關(guān)系與地理分布并不完全一致，地理距離相對(duì)更遠(yuǎn)的居群間（如浙江舟山和遼寧莊河）有著較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，分布在遼寧的5個(gè)珊瑚菜居群，聚在不同的分支，沒有表現(xiàn)出更近的親緣關(guān)系。

3 討 論

本研究首次采用ISSR分子標(biāo)記法，針對(duì)國(guó)內(nèi)采集的10個(gè)珊瑚菜野生居群進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，所選取的8對(duì)引物所產(chǎn)生的條帶數(shù)量多、相對(duì)穩(wěn)定、圖像清晰、多態(tài)性高（都在70%以上），說明ISSR分子標(biāo)記對(duì)研究珊瑚菜的遺傳多樣性是可行的。

3.1 珊瑚菜遺傳多樣性水平

居群是進(jìn)化的基本單元，而遺傳多樣性是居群生存和進(jìn)化的基礎(chǔ)，它受多種因素影響，包括繁殖體系、生物學(xué)特性、生態(tài)環(huán)境因素、人類活動(dòng)、演化史、種子散播機(jī)制等等［18－19］，物種的遺傳多樣性越高，其環(huán)境適應(yīng)能力就越強(qiáng)，這一點(diǎn)對(duì)于瀕危物種尤為重要［20］。本研究采用的8對(duì)引物共得到76條清晰的譜帶，其中多樣性條帶64條，多樣性條帶百分率為84.21%，居群水平Shannon多樣性指數(shù)為0.866 3，Nei’s多樣性指數(shù)為0.342 5，這些數(shù)據(jù)都說明了珊瑚菜野生居群具有較高的遺傳多樣性。造成遺傳多樣性高的原因可能與珊瑚菜的繁育系統(tǒng)、生境分布有一定關(guān)系，珊瑚菜屬于異交授粉的植株，其生境被海洋和陸地間隔成塊狀分布，使其個(gè)體在較小的分布區(qū)域進(jìn)行雜交授粉，從而導(dǎo)致居群內(nèi)個(gè)體間基因交流頻繁，形成了較高的物種多樣性。

3.2 影響珊瑚菜遺傳結(jié)構(gòu)的主要因素

遺傳結(jié)構(gòu)是指遺傳多樣性在居群內(nèi)和居群間的分布，是一個(gè)物種最基本的特征之一，受生境片斷化、居群分離、繁育系統(tǒng)、基因流等多因素的影響，本研究結(jié)果驗(yàn)證了這一說法。POPGENE分析結(jié)果表明，珊瑚菜居群平均遺傳分化系數(shù)為0.205 0，表明79.5%基因變異存在于居群內(nèi)；AMOVA分析顯示，珊瑚菜居群間遺傳分化水平為0.259 1，居群內(nèi)的遺傳分化水平為0.740 9；兩組數(shù)據(jù)結(jié)果一致，均表明居群內(nèi)遺傳變異高于居群間的遺傳變異。這可能與其復(fù)雜的繁育系統(tǒng)和片段化生境有關(guān)。珊瑚菜屬于多年生草本植物，其生殖方式是有性生殖，主要傳粉方式是蟲媒和風(fēng)媒，傳粉昆蟲為熊蜂［6］；其種子傳播途徑主要是風(fēng)和水，繁殖體系較復(fù)雜；其地理分布主要是不連續(xù)的島嶼，及被海洋隔離的陸地沙灘，花粉和種子的傳播范圍受到一定限制，由此，其居群內(nèi)的基因交流較高，遺傳變異水平較高；居群間的基因交流較低，也就具有較低的遺傳分化水平。

影響居群遺傳結(jié)構(gòu)的因素除繁育系統(tǒng)外，基因流也是一個(gè)重要因素。在群體遺傳學(xué)理論中，以基因流的臨界點(diǎn)為判別標(biāo)準(zhǔn)，不管居群大小，只要基因流大于或等于1時(shí)，就可以防止由遺傳漂變引起的居群間遺傳分化［21］。本研究中，珊瑚菜的基因流為1.939 1，說明珊瑚菜居群間有一定的基因交流，足以抵消遺傳漂變帶來的影響，也說明珊瑚菜居群具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。

3.3 遺傳結(jié)構(gòu)與地理分布的關(guān)系

UPGMA聚類分析顯示所有10個(gè)居群分為兩個(gè)大支，其中一支由浙江舟山、山東日照和遼寧鲅魚圈分布的居群組成，浙江舟山和山東日照的居群顯示有較近的遺傳關(guān)系，這與宋春鳳等［7］的研究結(jié)果基本一致；遼寧鲅魚圈居群沒有歸入遼寧其它居群的可能原因是，該處已開發(fā)為旅游海灘，原始生境遭到嚴(yán)重破壞，分布材料瀕臨絕跡，僅在此分布區(qū)發(fā)現(xiàn)5株樣品，全部采集參與分析，由于樣品較少，可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果有所偏離；另外一個(gè)大支，由山東海陽、河北秦皇島分布的居群和遼寧地區(qū)分布的5個(gè)居群組成，這7個(gè)居群又聚成2個(gè)小支，其中山東海陽、河北秦皇島居群和遼寧長(zhǎng)海分布的一個(gè)居群聚在一起，顯示較近的遺傳關(guān)系，而剩余4個(gè)遼寧地區(qū)分布的居群?jiǎn)为?dú)聚為一個(gè)小支。從聚類分析結(jié)果來看，居群間的親緣關(guān)系與地理分布并不完全一致，既表現(xiàn)在地理距離相距較遠(yuǎn)的居群有更遠(yuǎn)的親緣關(guān)系（如浙江舟山和遼寧莊河等居群），又被發(fā)現(xiàn)同一分布區(qū)的珊瑚菜居群聚在不同的分支（如遼寧分布的5個(gè)居群），如果排除采樣問題的偏差，可以推測(cè)長(zhǎng)距離范圍內(nèi)珊瑚菜可能會(huì)受生境片斷化的效應(yīng)影響，受到生境選擇的壓力，距離越遠(yuǎn)遺傳差異越大，而小范圍內(nèi)珊瑚菜的遺傳變異與地理分布則沒有呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性，即在一定空間尺度內(nèi)珊瑚菜居群間的遺傳距離與地理距離關(guān)系不大，表明差異不大的地理距離在珊瑚菜的遺傳分化中可能并非是主導(dǎo)因素，其遺傳分化的因素可能主要與珊瑚菜的繁育系統(tǒng)有關(guān)。本研究利用Mantel檢測(cè)的結(jié)果也說明地域分布與遺傳距離不存在顯著的相關(guān)性，如需深入探討該問題，增加取材范圍和更多的分子標(biāo)記分析是必要的。

3.4 保護(hù)珊瑚菜居群的措施

瀕危物種保護(hù)主要目標(biāo)就是維持物種的遺傳多樣性水平。本研究表明，珊瑚菜自身具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和遺傳多樣性水平，其瀕臨滅絕的原因除了其特殊的狹域生境［22］外，還應(yīng)主要?dú)w咎于外界其他因素，例如人類的過度采挖和海岸帶過度開發(fā)等對(duì)生境造成的毀滅性的破壞。珊瑚菜種質(zhì)資源的保護(hù)是非常必要也是非常有意義的，應(yīng)從以下幾方面著手：1）加強(qiáng)原始生境的保護(hù)；2）嚴(yán)禁野生珊瑚菜品種的采挖；3）考慮到珊瑚菜的居群內(nèi)具有較高的遺傳多樣性水平，選擇較大的居群進(jìn)行就地或異地建立種質(zhì)資源庫(kù)也是保護(hù)該物種的一個(gè)重要舉措。

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（編輯：宋亞珍）

Genetic Diversity of Glehnia littoralis Populations Revealed by ISSR Molecular Markers

WANG Ailan1，WANG Guilin1，LI Weiwei2＊
（1School of Life and Sciences，Ludong University，Yantai，Shandong 264025，China；2Ludong University Journal，Ludong University，Yantai，Shandong 264025，China）

In order to formulate conservation strategies of this species，We assessed the genetic diversity of G.littoralis with total 241samples of 10populations using molecular marker ISSR analysis.The result revealed that high levels of genetic variations occurred within and among populations（PPB＝84.21%，Ne＝1.562 8，I＊＝0.866 3，h＊＝0.342 5）.The genetic differentiation coefficient（GST）among populations was 0.205.Analysis of molecular variance（AMOVA）demonstrated that 25.91%of genetic diversity was found among populations，74.09%of genetic diversity was found within populations.The value of gene flow（Nm）was 1.939 1.It is indicated that the endangered status of this species is probably due to destruction of habitats of the wild populations，rather than a loss of the genetic diversity.

Glehnia littoralis；ISSR；genetic diversity；gene flow

Q789；Q949.763.3

A

1000－4025（2015）08－1541－06

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1541

2015－03－04；修改稿收到日期：2015－06－04

山東省自然科學(xué)基金（ZR2010CM056）

王愛蘭（1978－），女，博士，講師，主要從事分子生態(tài)學(xué)方面的研究。E－mail：alww05＠126.com

＊通信作者：李維衛(wèi)，碩士，講師，主要從事植物學(xué)方面的研究。E－mail：lwwal＠163.com