銀杏苦內酯B對脂多糖誘導的微血管內皮細胞作用的機制

陳凱 曹衛麗 夏時海

·論著·

銀杏苦內酯B對脂多糖誘導的微血管內皮細胞作用的機制

陳凱 曹衛麗 夏時海

目的觀察銀杏苦內酯B(BN52021)對胰腺微血管內皮細胞(MS1細胞)的作用，探討其分子機制。方法 采用MTT法確定脂多糖(LPS)抑制MS1細胞存活的最佳濃度和時間，同法確定BN52021增加LPS誘導后MS1細胞存活的最佳濃度。通過實時定量PCR、蛋白質印跡法檢測血小板活化因子受體(PAFR)信號通路中腺苷酸環化酶(AC)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLCβ)、酪氨酸蛋白激酶(PTK)和G蛋白耦聯受體激酶(GRK)mRNA和蛋白表達量。結果 10 μg/ml LPS作用24 h為抑制MS1細胞存活的最佳濃度和作用時間。50 mmol/L BN52021是最佳干預濃度。LPS誘導后MS1細胞株AC、GRK、PLA2、PLCβ、PTK mRNA表達量分別為4.02±0.14、2.63±0.03、3.31±0.12、2.09±0.08、1.85±0.07，較對照組(均為1)明顯上調；BN52021干預后MS1細胞AC、GRK、PLA2、PLCβ mRNA表達量分別為2.35±0.13、1.17±0.14、1.87±0.11、1.65±0.10，較LPS誘導組顯著下調，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，PTK mRNA表達量為1.83±0.13，與LPS誘導組差異無統計學意義。蛋白印跡法顯示各基因的蛋白表達與mRNA表達的變化一致。結論 BN52021能有效地下調LPS誘導MS1細胞后PAFR信號通路中被上調的AC、GRK、PLA2和PLCβ基因表達。

胰腺炎，急性壞死性； 銀杏苦內酯類； 脂多糖類； 微血管； 內皮細胞

大量證據表明，重癥急性胰腺炎(SAP)的許多并發癥是微循環紊亂的放大效應[1-3]導致的。血小板活化因子(PAF)是包括胰腺腺泡和微血管內皮細胞在內的各種細胞合成和分泌的生物活性磷脂，它與血小板活化因子受體(PAFR)結合，通過G蛋白轉導，活化磷脂酶C(PLC)、磷脂酶A2(PLA2)、腺苷酸環化酶(AC)和酪氨酸蛋白激酶(PTK)等，導致SAP的發生和發展[4]。本課題組既往研究結果顯示，PAF表達于大鼠的胰腺組織，在SAP的炎癥應答中起關鍵作用[5-6]。PAFR拮抗劑能夠阻斷PAF引起的炎癥和損傷。銀杏苦內酯B(BN52021)是從銀杏葉中提取的，作為一種潛在的PAFR拮抗劑可抑制PAF誘導的炎癥級聯反應[7-9]。本研究應用BN52021干預脂多糖(LPS)誘導的胰腺微小血管內皮細胞(MS1細胞)，觀察PAF受體(PAFR)信號通路中AC、PLA2、PLC β、PTK和G蛋白耦聯受體激酶(GRK)的表達變化，探討BN52021作用的分子機制。

材料與方法

一、LPS誘導MS1細胞的最佳濃度、作用時間及最佳BN52021干預濃度確定

小鼠胰腺微小血管內皮細胞株(MS1)購自中國科學院上海生命科學研究院，常規復蘇、培養、傳代。取對數生長期細胞接種96孔板，每孔103細胞，200 μl培養基。培養至細胞密度75%時分為4組：不加LPS的對照組,0.1、1、10 μg/ml LPS組，分別繼續培養3、6、12、24 h，每組每個時間點設3個復孔。到培養時間點時加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續培養4 h，加入150 μl DMSO，震蕩10 min，上酶標儀測各孔在波長490 nm處的吸光度值(A490值)。LPS及MTT均為Sigma公司產品。

取對數生長期細胞接種96孔板，每孔103個細胞，200 μl培養基。培養至細胞密度75%時分為6組：對照組、LPS組、LPS+DMSO組、LPS+10mmol/L BN52021組、LPS+50 mmol/L BN52021組、LPS+100 mmol/L BN52021組，每組3個復孔。參考De Kimpe等[10]的方法，先在相應孔分別加入10、50、100 mmol/L BN52021，同時加入2 μl DMSO(因BN52021需要用DMSO溶解)，干預20 min后再在相應組分別加入最佳的LPS誘導濃度，取最佳作用時間進行培養。同樣采用MTT法測定成活細胞的A490值。BN52021購自Sigma公司。

二、MS1細胞AC、PLA2、PLCβ、PTK、GRK mRNA表達檢測

取對照組、LPS組、LPS+DMSO組、LPS+50 mmol/L BN52021組MS1細胞，采用Trizol提取細胞總RNA。Trizol購自invitrogen公司，按說明書操作。取2 μl(1 μg)總RNA加入逆轉錄試劑盒MIX體系中行逆轉錄。取逆轉錄產物2 μl在Applied Biosystems公司StepOnePCR儀進行實時PCR反應。AC上游引物5′-GACTTTGTTCTCCGAGTTG-3′，下游引物5′-GTGCTATCCATCCGACTG-3′，產物122 bp，退火溫度49℃；PLA2上游引物5′-GAATAAAGGCTCTACAATGG-3′，下游引物5′-GTTGTCGCTTTGGTACTC-3′，產物149 bp，退火溫度49℃；PLC β上游引物5′-CCTCAACTTCAACCGAGTT-3′，下游引物5′-CAGAGTGAGGTACGGCTTG-3′，產物148 bp，退火溫度49℃；PTK上游引物5′-CACTGCGATGTCACATTG-3′，下游引物5′-CACTATGTTCGGGACTGG-3′，產物147 bp，退火溫度49℃；GRK上游引物5′-AAGCCAGCCAACATTCTC-3′，下游引物5′-CCCTTCTGTAGGACTTCG-3′，產物140 bp，退火溫度51℃；內參GAPDH上游引物5′-CATCTTCCAGGAGCGAGAC-3′，下游引物5′-GGCTAAGCAGTTGGTGGTG-3′，產物250 bp，退火溫度50℃。引物均由北京奧克鼎盛公司合成。逆轉錄試劑盒及實時PCR試劑盒購自北京全式金公司。使用PCR儀自帶的stepone software v2.1軟件獲取與內參的相對定量值。

三、細胞中磷酸化AC(p-AC)、p-PLA2、PLCβ、p-PTK、GRK蛋白表達檢測

取上述各組細胞，應用碧云天細胞裂解液裂解細胞30 min，再超聲裂解1 min，4℃離心取上清即為細胞蛋白，應用碧云天BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量。 取60 μg蛋白行蛋白質印跡法檢測細胞p-AC、p-PLA2、PLCβ、p-PTK、GRK蛋白表達。兔抗小鼠p-PTK、p-AC多抗購自abcam公司，GRK多抗購自Epitomics公司，p-PLA2多抗購自cell signaling公司，β-actin多抗購自abmart公司，羊抗兔IgG購自ProteinTech公司。最后ECL發光，X膠片曝光、顯影、定影。應用Quantity One4.6.2凝膠分析軟件計算目的條帶與內參β-actin條帶灰度值比，表示蛋白相對表達量。

四、統計學處理

結 果

一、LPS誘導MS1細胞的最佳作用濃度、時間及BN52021干預的最佳濃度

0.1 μg/ml LPS誘導12 h以上以及1、10 μg/ml LPS誘導6 h以上均能顯著減少成活的MS1細胞數量，與對照組比較，差異均有統計學意義(P值均<0.01，表1)，其中以10 μg/ml LPS誘導24 h的作用效果最佳。

對照組、LPS組、LPS+DMSO組、LPS+10mmol/L BN52021組、LPS+50mmol/L BN52021組、LPS+100 mmol/L BN52021組的A490值分別為0.20±0.01、0．14±0.02、0.16±0.03、0.14±0.02、0.20±0.03、0.17±0.02。應用50 mmol/L BN52021干預MS1細胞20 min后，再用10 μg/ml LPS誘導細胞24 h，MS1細胞的成活數量最多，較10 μg/ml LPS組的差異有統計學意義(P<0.05)，與未用LPS誘導的對照組細胞成活數量相近，為最佳干預濃度。

二、MS1細胞AC、PLA2、PLCβ、PTK、GRK mRNA表達變化

LPS組、LPS+DMSO組、LPS+50mmol/L BN52021組MS1細胞AC、PLA2、PLCβ、PTK GRK、mRNA表達量較對照組顯著上調，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。BN52021干預后MS1細胞AC、PLA2、PLCβ、GRK mRNA表達量較LPS誘導后的表達量顯著下調，差異均有統計學意義(P<0.05或<0.01)，PTK mRNA表達量在BN52021干預前后無顯著變化(表2)。

三、MS1細胞p-AC、p-PLA2、p-PTK、GRK、PLCβ蛋白表達變化

LPS誘導的MS1細胞p-AC、p-PLA2、GRK、PLC β蛋白表達較對照組顯著上調(P<0.05)，BN52021干預后p-AC、p-PLA2、GRK、PLCβ蛋白表達顯著下調，與LPS誘導組的差異均有統計學意義(P值均<0.05)。MS1細胞p-PTK蛋白表達在各組間的差異均無統計學意義(表3、圖1)。

表1 不同LPS濃度及時間誘導后成活的MS1細胞(A490值

注：與對照組比較，aP<0.05,bP<0.01

表2 各組細胞AC、PLA2、PLCβ、PTK、GRK mRNA表達量變化

注：與對照組比較，aP<0.05；與LPS組比較，bP<0.05,cP<0.01

表3 各組MS1細胞p-AC、p-PLA2、p-PTK、GRK、PLCβ蛋白表達變化

注：與對照組比較，aP<0.05；與LPS組比較，bP<0.05

圖1 對照組(1)、LPS組(2)、LPS+DMSO組(3)、LPS+50 mmol/L BN52021組(4)MS1細胞p-AC、p-PLA2、p-PTK、GRK、PLCβ蛋白表達(蛋白質印跡法)

討 論

PAFR屬于G蛋白耦聯受體家族[11],PAF與受體結合后的細胞內信號轉導可能途徑[12-13]：(1)通過G蛋白轉導激活PLCβ后通過第二信使激活NF-κB將信號轉導入核。(2)通過G蛋白轉導激活AC經由cAMP依賴蛋白激酶A(PKA)將信號轉導入核。(3)經由直接或者間接途徑激活PTK。此外， PLA2可以通過再修飾途徑經乙酰輔酶A合成PAF激活PAFR通路。

近年來人們越來越關注SAP發病機制中PAF信號通路的重要性[7,14-15]。因PAFR幾乎普遍存在于各種類型的細胞，故PAFR通路可引起全身炎癥應答和多種器官損傷[16]。孫文佳等[17]報道，通過加入PAFR通路阻斷劑可以降低高糖誘導的內皮細胞的TLR4通路活化，從而抑制NF-κB因子的核移位，減輕炎癥反應。Richardson等[18]報道，在大鼠第四腦室注射LPS誘發的急性神經炎性反應中，炎性反應程度與PAF等細胞因子水平呈正相關，且PAF間接或直接地提高了腦內的谷氨酸水平，從而激活谷氨酸受體，使神經元死亡[19]。PAF也是SAP發病機制中的始動因素，其中的PLA2信號因子扮演重要角色，其細胞毒作用可以加劇炎癥的發展[20]。有研究報道，應用PLA2阻斷劑干預急性壞死性胰腺炎大鼠后IL-1β等炎性因子表達量明顯下降[21]。銀杏苦內酯作為PAFR的天然阻斷劑已被學者發現和證實[17,22]，它在多器官組織中通過阻斷PAFR信號通路減輕組織炎癥應答[17,23]。本課題組前期的研究工作證實，BN52021干預AP大鼠后可抑制PLA2活化，拮抗PAFR通路激活所造成的胰腺損傷[24]，其機制可能通過競爭性結合表達上升的PAFR蛋白所致[25]。

本研究結果顯示，GRK 及其相關因子AC、PLA2、PLCβ mRNA及蛋白表達在LPS刺激后顯著上調，BN52021干預后GRK mRNA表達降至幾近正常水平， AC、PLA2 PLCβ mRNA表達也被顯著抑制，表明BN52021能夠有效改善LPS刺激后MS1細胞的生存狀況，機制可能與BN52021抑制LPS刺激后PAFR信號通路中上調的AC、GRK、PLA2和PLC β表達有關。PKT在BN52021干預前后無明顯變化，表明該基因不參與PSFR信號通路轉導。

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(本文編輯：呂芳萍)

Mechanism of effect of Ginkgolide B on lipopolysaccharide induced microvascular endothelial cells

ChenKai,CaoWeili,XiaShihai.CenterofHepatopancreatobiliaryandSplenic,AffiliatedHospital,LogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForce,Tianjin300162,China

Correspondingauthor:XiaShihai,Email:xshhcx@sina.com

Obiective To investigate the effect of Ginkgolide B (BN52021) on lipopolysaccharide(LPS) induced pancreas microvascular endothelialv(MS1) cells, and to explore its molecular mechanism. Methods The optimal concentration and best time point of LPS inhibing MS1 cell survival and the optimal concentration of BN52021 increasing survival of LPS induced MS1 cells were determined by MTT. The mRNA and protein expression of adenylate cyclase(AC), phospholipase A2(PLA2), phospholipase Cβ(PLCβ), protein tyrosine kinase(PTK) and G protein coupled receptor kinase (GRK) in platelet activating factor receptor(PAFR) signal pathway in MS1 cells were determined by real-time PCR and Western blot. Results It was showed that 10 μg/ml LPS for 24 h was the optimal concentration and best time point to induce the decrease of MS1 cells. 50 mmol/L of BN52021 was the optimal concentration of increacing survival of LPS induced MS1 cells. After LPS induction, AC, GRK, PLA2, PLCβ, PTK mRNA expressions of MS1 cells were 4.02±0.14, 2.63±0.03, 3.31±0.12, 2.09±0.08, 1.85±0.07, which were significantly higher than those in control group (P<0.01). After BN52021 treatment, AC, GRK, PLA2, PLCβ mRNA expressions of LPS induced MS1 cells were 2.35±0.13, 1.17±0.14, 1.87±0.11, 1.65±0.10, which were significantly lower than those in LPS induction group (P<0.01). The expression of PTK mRNA was 1.83±0.13, which was not significantly different from that in LPS induction group. Western blot showed that the levels of protein expression were consistent with those of mRNA expression. Conclusions BN52021 can down-regulate the up-regulated genes expression of AC, GRK, PLA2 and PLCβ in the PAFR signal pathway in LPS induced MS1 cells.

Pancreatitis, acute necrotizing; Ginkgolides; Lipopolysaccharides; Microvessels; Endothelial cells

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.06.007

國家自然科學基金資助項目(81173393)；天津市應用基礎及前沿技術計劃重點項目(12JCZDJC25500)；武警后勤學院附屬醫院基金面上項目(FYM201522)；西青醫院院級課題基金面上項目(XQLX201406)

300162 天津，中國武裝警察部隊后勤學院附屬醫院肝膽胰脾中心

夏時海，Email：xshhcx@sina.com

2015-04-03)