中華鱉轉鐵蛋白基因序列特征及表達研究

李 偉史 燕趙 建洪孝友朱新平

(1. 中國水產科學研究院珠江水產研究所, 農業部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室, 廣州 510380; 2. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306)

中華鱉轉鐵蛋白基因序列特征及表達研究

李 偉1,2史 燕1趙 建1,2洪孝友1朱新平1,2

(1. 中國水產科學研究院珠江水產研究所, 農業部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室, 廣州 510380; 2. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306)

轉鐵蛋白是呼吸鏈的關鍵因子, 參與體液和免疫系統的調節, 具有抗菌抗病毒等功能。研究從嗜水氣單胞菌誘導的中華鱉肝臟SMART cDNA文庫中, 分離克隆了中華鱉轉鐵蛋白基因cDNA和gDNA全序列,對其序列特征、組織表達及原核表達進行了分析研究。結果顯示, 中華鱉轉鐵蛋白對應全長cDNA的基因組DNA全長為19100 bp, 由17個外顯子和16個內含子組成; cDNA全長為2359 bp, 開放閱讀框為 2094 bp, 編碼697個氨基酸; 轉鐵蛋白的分子量為76.6 kD, 包含2個糖基化位點, 存在4個二硫鍵形成區域的缺失, 兩個同源結構域的相似性為37%, 信號肽位于第1—19位點。熒光定量PCR結果顯示, 正常組中華鱉轉鐵蛋白基因在肝臟中的表達量最大; 以嗜水氣單胞菌刺激后, 其在心、肝、脾和腎臟組織中的表達, 均有一個上調后減少的趨勢。此外, 實驗還進行了重組轉鐵蛋白原核表達和Western blot 檢測鑒定, 為深入研究中華鱉轉鐵蛋白功能的提供了基礎數據。

中華鱉; 轉鐵蛋白; 序列分析; 組織表達; 原核表達

中華鱉(Pelodiscus sinensis)是我國重要的水產養殖品種之一[1,2], 2012年養殖產量已達3.3×108kg[3]。在養殖規模擴大過程中, 出現了一些不規范的養殖方式, 產生一些影響產業健康發展的瓶頸問題, 種質混雜、種苗質量參差不齊、疾病頻發等現象普遍存在[4]。近年來, 人們開始重視中華鱉的良種培育,特別是中華鱉抗病優良品種的培育。因此, 與中華鱉抗病免疫相關基因結構與功能的研究也越來越多[5]。

轉鐵蛋白(Transferrins Tf)分布于動物不同器官和組織, 具有不同的生理特性[6], 是細胞攝入鐵的主要輔助因子之一, 是呼吸鏈的關鍵因子, 參與體液和免疫系統的調節, 具有氧化還原作用, 還是抑制細菌繁殖的重要因子[7,8]。目前, 轉鐵蛋白在人類(Homo sapiens)、家鼠(Rattus noruegicsu)等哺乳動物和魚類中研究報道較多[7—9], 在龜鱉動物中的研究報道較少, 僅在黃喉擬水龜(Mauremys mutica)、紅耳龜(Trachemys scripta elegans)、綠海龜(Chelonia mydas)中有一些相關研究[10,11]。中華鱉轉鐵蛋白基因的相關研究則尚未見報道。

近年通過構建cDNA文庫來獲取基因全長序列及進行EST分析的方法在生物學研究領域得到了長足的發展及廣泛的應用[5,12]。本研究根據對實驗室現有的嗜水氣單胞誘導的中華鱉肝臟全長 cDNA文庫的分析, 選擇了表達豐度較高的轉鐵蛋白基因進行研究。在轉鐵蛋白 cDNA全長序列基礎上, 采用PCR及TA克隆方法, 獲得轉鐵蛋白gDNA全長序列, 并對其基因結構、組織表達及原核表達進行了研究, 以期為探索中華鱉轉鐵蛋白在機體中的免疫機制提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗中華鱉 本實驗所用中華鱉取自綠卡實業有限公司(廣東省, 東莞市), 共 33只, 平均體重為(160±16) g, 體表完好健康。隨機取3只作為空白組, 其他30只隨機分為5組, 每組6只(其中隨機3只為對照組, 其余3只為實驗組)?？瞻捉M不做處理,實驗組腹腔注射500 μL濃度為1010cfu/mL新鮮培養的嗜水氣單胞菌, 對照組腹腔注射 500 μL生理鹽水(0.75%), 分別在0、12h、24h、36h和48h采集樣本。

實驗試劑 致病嗜水氣單胞菌菌株, 由珠江水產研究所譚愛萍老師提供。PCR反應試劑、感受態細胞以及PCR切膠回收試劑盒等均購自廣州合達生物科技有限公司; 原核表達、Western-blot試劑、引物合成、RNA以及DNA提取試劑盒等均購自英濰捷基(上海)貿易有限。

1.2 實驗方法

基因組 DNA和總 RNA提取、反轉錄及 Tf gDNA全長序列克隆 取中華鱉肝、脾、腎、心等組織, 液氮速凍后–80℃冰箱保存備用。用試劑盒提取各組織總RNA后反轉錄為cDNA, 并提取空白組基因組DNA。以基因組DNA為模板, 根據Tf 基因 cDNA全長序列設計特異性引物, 擴增 Tf 基因gDNA全長。總RNA提取、cDNA反轉錄、PCR反應體系、產物純化回收、連接及單克隆測序等參照高明英等的方法[10]。

組織表達 實時熒光定量 PCR采用 SYBR Green I 染料法在DNA Engine Chromo 4 Real-Time (美國 ABI公司)系統上進行, 并采用相對 CT法(2–△△Ct法)來計算相對表達量。以反轉錄的 cDNA為模板, 以 actin-F (TGTTACCCATACTGTGCCC ATC) 和 actin-R (GCCATCTCCTGTTCAAAATCCA)為內參, 用 Tf 特異性引物 TFf/TFr (CTACAACT ACTGGACCGACATTCA/ACACTTCTCCTTCTCG T GCTTAC)對試驗樣本進行熒光定量PCR分析, 每組設三個重復。

原核表達及 Western-blot印記分析 采用In-Fusion法進行重組表達載體的構建, 以合成的cDNA為模板, 以特異性引物TF1f/TF1r (CGATATC CGACCTGGAGCAGAGTAA/GAACAGGCTGGAC TCCTCTTG)和TF2f/TF2r (GTGCCGCGCGGCAGC CATATGGCCGACGTGATCCCGGCATT/TGGTGGT GGTGGTGCTCGAGCTAAGCCAAGGTCGTCAAG TCGCT)進行目的片段的擴增。PCR產物純化、回收后連接到pET-32a載體上, 構建pET-32a-PSTf 表達載體, 并將重組后的質粒轉化到 BL21感受態細胞中。誘導表達和SDS-PAGE凝膠電泳分析方法按高明英等的方法[10]。在 SDS-PAGE電泳后, PVDF膜甲醇中浸泡20s, 然后轉移到Tris-Glycine轉移緩沖液(5%甲醇)中平衡至少 5min; SDS-PAGE膠在Tris-Glycine轉移緩沖液平衡至少30min; 在冷卻條件下以 100 v恒壓轉膜 2h。轉膜結束后, 放到T-TBS(含5%脫脂奶粉)室溫封閉1h, 然后T-TBS漂洗3次, 每次5min。用增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒鑒定表達產物。

序列分析和統計學分析 用Vector NTI 11.5對獲得的DNA序列進行拼接和分析。利用在線分析軟件Expasy、ScanProsite和 SingalP 4.1對氨基酸序列進行分析[13,14]。用CLUSTALX2軟件和MEGA 5.0程序, 以最大似然法(ML)構建系統發育進化樹[15]。用ESyPred3D web server 1.0構建Tf的三維結構, 并用 RasMol-Raindy軟件分析[10]。運用統計學軟件SPSS 11.5進行單因素相關性分析, 實驗組與對照組間P＜0.05為差異顯著, P＜0.01則為差異極顯著。

2 結果

2.1 中華鱉轉鐵蛋白基因序列分析

Tf基因序列分析 中華鱉轉鐵蛋白cDNA全長為2359 bp。開放閱讀框(Open reading frame, ORF)長度為 2094 bp, 起始密碼子為 ATG, 終止密碼子為TAG, 編碼697個氨基酸。其5′ UTR長為46 bp, 3′-UTR長217 bp, 且3′端存在一個33 bp的PolyA序列。其中, mRNA 3′端的加尾信號(AATAAA)位于polyA上游21 bp處。通過NCBI數據庫, 將中華鱉轉鐵蛋白的cDNA序列進行blastn對比分析, 結果顯示: 與其同源性最高的為綠海龜、紅耳龜和黃喉擬水龜, 均高達 97%, 其次是揚子鱷(Alligator sinensis)、豹紋守宮(Eublepharis macularius)、綠頭鴨(Anas platyrhynchos), 相似性均大于80%。構建的23個物種的轉鐵蛋白發育進化樹(圖1)顯示, 4種龜鱉目動物在進化樹中首先聚類, 后與爬行類和鳥類聚類在一起, 然后與哺乳類聚類在一起, 但與兩棲類在進化樹上的距離比較遠。

中華鱉轉鐵蛋白對應全長cDNA的基因組DNA全長為19100 bp, 其中包含16個內含子, 17個外顯子。每個內含子都包含剪切供體或受體連接處的“GT/AG”序列特征(表1)?；蚪MDNA與cDNA序列結構比較(圖 2), 其中 ORF區的起始密碼子位于第一個外顯子處, 終止密碼子位于最后一個外顯子處。5′端和3′端非編碼區均為單一外顯子, 不包含內含子。

圖1 23個物種轉鐵蛋白基因的系統發育進化樹Fig. 1 The phylogenetic tree of Tf gene of 23 species

圖2 中華鱉轉鐵蛋白基因cDNA及DNA結構示意圖Fig. 2 The above schematic diagram shows the structural features of cDNA and genomic DNA of Pelodiscus sinensis Tf

表1 中華鱉轉鐵蛋白基因內含子與外顯子的接點及兩側的序列Tab. 1 Intron-exon junctions and flanking sequences of Tf gene of Pelodiscus sinensis

Tf基因結構分析 根據ProtParam在線軟件分析, 中華鱉轉鐵蛋白分子量為 76.6126 kD, 分子式為 C3376H5230N912O1044S41, 共包含 10603個原子,理論等電點(pI)為6.07。利用SignalP 4.1 Server在線工具對其氨基酸序列分析, 在序列的第1至第19位點,發現信號肽序列“MRFAPRAALAWALLVFCSA”。利用 ScanProsite在線工具, 預測中華鱉轉鐵蛋白的結構功能位點, 信號肽后的氨基酸序列可以分為兩個同源的結構域: N-端的結構域(23—340位點)和C-端的結構域(349—678位點), 兩個同源結構域的相似性為37%, 中間間隔8個氨基酸。每個結構域均包含兩個亞基, 并分別具有4個重金屬(Fe3+)結合位點(為Asp76/Asp399、Tyr108/Tyr436、Tyr 202/Tyr 532和 His261/His600)和 4個碳酸根陰離子(CO32–)結合位點(為 Thr76/Thr399、Arg108/Arg436、Ala 202/ Ala532和Gly261/ Gly600)。此外, 中華鱉Tf還包含11個二硫鍵形成區域(N-端5個和C-端6個)、糖基化位點2個、酰胺化位點3個、?；稽c10個、蛋白激酶C磷酸化位點10個、cAMP- and cGMP-dependent 蛋白激酶磷酸化位點 2個以及酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點20個。發現了轉鐵蛋白家族的標志序列, 分別為 108—117(序列為 YySVAVVKKG)、436—445(序列為YyAVAVVKKS)和532—547 (序列為YtGAFRCLvek.GDVAF)。

使用ExPASy在線分析中的SOPMA功能對中華鱉轉鐵蛋白氨基酸序列的二級結構進行分析, 其中α螺旋數占全結構的31.28%, 延伸鏈占17.79%, β轉角占5.88%, 不規則卷曲占45.05%。利用EsyPred 3D web server 1.0在線軟件, 對中華鱉轉鐵蛋白氨基酸序列的三級結構進行預測。蛋白的高級結構顯示(圖3), 中華鱉Tf由兩個半球型功能結構葉反向結合構成一個完整的球蛋白構象; 每個功能結構域分為兩個子結構域, 互靠近構成Fe3+和CO32–的結合區域。

2.2 中華鱉轉鐵蛋白基因組織表達特征

正常狀態下中華鱉轉鐵蛋白基因組織表達特征通過實時熒光定量PCR檢測, 轉鐵蛋白基因在正常(空白組)中華鱉的 4個組織中的相對表達量, 以β-actin為內參基因, 其中轉鐵蛋白基因在腎臟組織的表達設定為10, 其他3個組織的表達量分別是相對腎臟組織的表達量(圖4)。結果表明轉鐵蛋白基因在中華鱉的心臟、肝臟、脾臟和腎臟組織中均有表達。其中在肝臟中的表達量最高, 且與其他組織相比差異極顯著(P＜0.01)。脾臟組織的表達量次之, 且與其他組織相比差異顯著(P＜0.05)。在心臟和腎臟組織中的表達量較低。

圖3 中華鱉轉鐵蛋白三級結構預測圖Fig. 3 The tertiary structure of Pelodiscus sinensis Tf

嗜水氣單胞菌刺激誘導后中華鱉轉鐵蛋白基因組織表達特征 為了進一步研究轉鐵蛋白的功能,實驗設置了嗜水氣單胞菌誘導實驗, 分別在中華鱉感染后0、12h、24h、36h和48h后采集對照組和實驗組樣本, 通過實時熒光定量PCR檢測中華鱉在嗜水氣單胞菌誘導刺激后, 轉鐵蛋白基因在中華鱉心臟、肝臟、脾臟和腎臟組織中的表達情況。結果表明, 隨著誘導時間的推移, 轉鐵蛋白基因在心臟、肝臟、脾臟和腎臟組織中的表達均為先被誘導上調后減少的動態變化趨勢(圖5)。其中, 中華鱉在嗜水氣單胞菌誘導 12h后, 轉鐵蛋白基因在肝臟和心臟中的表達出現了顯著上調(P＜0.05), 實驗組分別是對照組的6.05倍和1.89倍; 在誘導24h后, 轉鐵蛋白在脾臟中的表達出現了顯著上調(P＜0.05), 實驗組分別是對照組的5.60倍; 在誘導36h時, 轉鐵蛋白在腎臟中的表達出現了顯著上調(P＜0.05), 實驗組分別是對照組的1.69倍。

2.3 中華鱉轉鐵蛋白原核表達及Western blot鑒定

將pET-32a-Tf重組質粒轉化到大腸桿菌BL21,重組菌經0.8 mmol/L IPTG 37℃分別誘導表達1h、2h、3h及4h后, 與空載BL21/pET重組菌(37℃誘導4h)的結果一起通過SDS-PAGE電泳檢測(圖6)。重組誘導菌與空載菌比較發現, 在目標條帶處出現了很強的蛋白條帶, 且與理論推算的蛋白分子量(95 kD)相符。IPTG誘導3—4h的表達菌, 融合蛋白的表達量較大。以pET-32a 為表達載體所表達的融合蛋白帶 His標簽, 實驗以 His-probe 抗體(H-15) (sc-803)為一抗, 羊抗兔 IgG-HRP(美國 Pierce)為二抗。進行 Western blot檢測(圖 7)。進行 Western blotting 分析在 95 kD 位置出現了特異的反應帶,特意條帶的位置與預期相符, 表明蛋白表達成功。

圖 5 不同感染時間中華鱉轉鐵蛋白基因在不同組織中的表達特征Fig. 5 The expression characteristics of Pelodiscus sinensis TF in different tissues with different stimulation time

圖6 重組菌表達SDS-PAGE電泳檢測結果Fig. 6 SDS-PAGE of Pelodiscus sinensis Tf expressed in BL21

圖7 Western blot 檢測中華鱉重組轉轉鐵蛋白Fig. 7 Western blot analysis of the recombinant transferrin of Pelodiscus sinensis TF

3 討論

自 1945年人類轉鐵蛋白首次從血清鑒別出以來, 關于轉鐵蛋白的研究一直持續至今[16]。人類和家鼠等哺乳動物的轉鐵蛋白相關研究已經深入到臨床檢測和治療應用等方面[5,17]。但是龜鱉動物的相關研究卻剛剛開始, 僅在黃喉擬水龜、紅耳龜、綠海龜中有一些相關研究報道[10,11]。

中華鱉轉鐵蛋白基因組DNA序列包含16個內含子和 17個外顯子, 與家鼠、石斑魚(Epinephelus awoara)和黃喉擬水龜的轉鐵蛋白基因組DNA結構組成相似[10,18]。但有報道稱, 人的Tf 有17個內含子和18個外顯子, 其編碼區起始于第2個外顯子[19]。中華鱉轉鐵蛋白cDNA的ORF區可編碼697個氨基酸組成的多肽鏈, 比黃喉擬水龜短 9個氨基酸, 但兩者信號肽長度相同[10]。在目前已報道的人、鼠、鳥類、魚類以及兩棲爬行類中, 轉鐵蛋白具有高度保守的功能結構域[20]。中華鱉具有典型轉鐵蛋白結構, 含有兩個相似的同源結構域, 相似性為 37%,黃喉擬水龜、草魚(Ctenopharyngodon idellus)、人和真鯛(Pagrosomus major)的為 38.4%[10]、40%[19]、31%[21]和36%[22]。每個結構域都含有 4個Fe3+和4個CO32–結合位點, 可以可逆結合運輸金屬離子, 完成生理功能。中華鱉轉鐵蛋白的鐵離子結合位點包括1個Asp76、1個His和2個Tyr, 和人轉鐵蛋白X-ray構象研究的結果相一致, 這些活性功能位點高度保守[20]。

研究發現, 轉鐵蛋白的兩個結構域起源于機體進化中基因復制形成的, 且 C-端結構域與鐵離子的結合作用更穩定[23]。二硫鍵對蛋白質構象起維持穩定作用, 多數脊椎動物的轉鐵蛋白通常具有 15 個二硫鍵[24]: N端6個和C端9個。但中華鱉和黃喉擬水龜一樣均存在二硫鍵形成區域的缺失情況, 均在N端缺少1個, C端缺少3個。在C端, 中華鱉比黃喉擬水龜多一個糖基化位點, 增加了 C-端結構域的穩定性和可修飾性。

對基因組織表達和免疫刺激表達圖譜的研究,是分析基因功能的重要方法, 也可直接反應其免疫相關性。實驗結果表明, 正常中華鱉轉鐵蛋白基因在肝臟中的表達量最高, 與黃喉擬水龜[10]等其他很多脊椎動物相似。雞的肝臟灌流實驗顯示肝臟是轉鐵蛋白的主要合成組織, 揭示了轉鐵蛋白在肝臟組織中較高表達量的原因[25]。以嗜水氣單胞菌刺激后,中華鱉轉鐵蛋白基因在心、肝、脾和腎臟組織中的表達量均有上調, 表明轉鐵蛋白參與了中華鱉的免疫應答反應。其中, 轉鐵蛋白基因在肝臟組織中的表達最先呈現顯著上調, 且在肝臟和脾臟組織中的表達上調趨勢最明顯。通過嗜水氣單胞菌的免疫刺激, 激活了中華鱉先天免疫系統, 可能導致呼吸或體液的改變, 誘導肝臟合成更多的轉鐵蛋白。脾臟是重要的造血器官和免疫器官, 嗜水氣單胞菌引起轉鐵蛋白在脾臟中的表達上調[21]。此外, 中華鱉轉鐵蛋白原核表達的成功, 為此后蛋白分離純化、抗菌活性以及功能研究奠定了基礎。

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MOLECULAR CHARACTERISTICS AND THE EXPRESSION OF TRANSFERRIN GENE IN CHINESE SOFT SHELL TURTLE

LI Wei1,2, SHI Yan1, ZHAO Jian1,2, HONG Xiao-You1and ZHU Xin-Ping1,2
(1. Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation of Ministry of Agriculture, Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China; 2. College of Fisheries and Life, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Transferrin has a variety of biological functions such as iron transportation, anti-microbial, and immunoregulation. In this study, we isolated the full length cDNA of transferrin of Chinese soft shell turtle (Pelodiscus sinensis) from the constructed liver cDNA library. The cDNA sequence consisted of 2359 bp, including an open reading frame (ORF) of 2094 bp which could encode a 674-aa peptide. The genomic DNA of transferrin consisted of 19100 bp and contained 17 exons and 16 introns, with a structure similar to that of other vertebrates. Using the online software we predicted the molecular characteristics of transferrin. The results indicated that the N-lobe of transferrin had a signal peptide of 19 amino acids; this gene was composed of two similar domains with a similarity of 37%. There were 2 N-linked glycosylation sites in the N-lobe, and 11 disulfide bonding formation areas in amino acids peptide. The quantitative PCR results showed that the expression of transferrin was the highest in liver in the normal group. The results also showed that after the infection with Aeromonas hydrophila the expression of this gene was first increased and then decreased in liver, spleen, kidney and heart, and the increase was particularly high in liver and spleen. Moreover, we applied western-blot to testify the prokaryotic expression of transferrin of Chinese soft shell turtle. This study could provide insights into the biological functions of transferrin in non-specific immune responses.

Chinese soft shell turtle; Transferrin; Sequence analysis; Tissue-specific expression; Prokaryotic expression

Q781

A

1000-3207(2015)03-0482-08

10.7541/2015.64

2014-06-06;

2014-09-12

廣東省海洋漁業科技推廣專項(A201201E05); 廣東省科技計劃項目(2012B020307003); 廣州市珠江科技新星專項(2012J2200091)資助

李偉(1984—), 女, 山東聊城人; 博士研究生; 研究方向為種質資源與遺傳育種。E-mail: 15013083966@163.com

朱新平(1964—), 男, 研究員, 博士生導師; E-mail: zhuxinping_1964@163.com