水華魚腥藻類菌胞素氨基酸的分子鑒定和化學檢測

劉 洋高合意李效宇李仁輝

(1. 河南師范大學生命科學學院, 新鄉 453007; 2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072)

水華魚腥藻類菌胞素氨基酸的分子鑒定和化學檢測

劉 洋1高合意2李效宇1李仁輝2

(1. 河南師范大學生命科學學院, 新鄉 453007; 2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072)

類菌胞素氨基酸 (MAAs) 是一類具有吸收紫外線能力的物質, 藍藻MAAs的生物合成及其分子機制的揭示為 MAAs基因的快速檢測提供了可能。研究采用分子生物學方法擴增了一株分離自太湖的水華魚腥藻(Dolichospermum flos-aquae CHAB1629)編碼脫氫醌合成酶(DHQS)基因的部分片段, 系統樹分析發現其與報道的Anabaena sp. 90核酸序列相似度達99%, 而與Anabaena variabilis ATCC 29413僅為53.6%; 同時運用HPLC檢測發現, 該株水華魚腥藻MAAs的類型為shinorine。研究結果可為后續浮游類魚腥藻MAAs的分子鑒定及野外適應性研究提供依據。

藍藻; 水華魚腥藻; 類菌胞素氨基酸; 高效液相色譜

類菌胞素氨基酸(Mycosporine-Like Amino Acids, MAAs)是一大類以環己烯酮為基本骨架、與不同類型氨基酸縮合形成的水溶性物質, 共軛雙鍵的結構特征以及側鏈的活性基團決定了其具有強紫外(310—360 nm)吸收的能力(圖1)[1,2]。MAAs在自然界分布廣泛, 從早期在真菌中發現至今(Leach 1965), 已在多種浮游植物類群中發現, 如藍藻、紅藻等。同時MAAs的化學結構多樣, 目前已發現了近30種, 2013年, Nazifi等[3]和Miyamoto等[4]報道在地木耳(Nostoc commune)中新發現了兩種不同類型的MAAs。研究表明, MAAs還具有光保護和抗氧化、防止珊瑚漂白、調節細胞滲透壓、調節休眠體細胞形成及萌發、增強細胞耐受干旱和高溫等多種作用, 其主要的抗紫外作用已被應用于相關護膚品的商業開發[1,5]。雖然MAAs較早就被發現, 然而其生物合成機制的研究較為滯后, 1999年Shick[6]對產MAAs珊瑚的草甘膦抑制實驗首次證實了 MAAs的莽草酸合成途徑; 隨后Balskus 和 Walsh[1]揭示了藍藻 MAAs合成的分子機制, 他們在Anabaena variabilis ATCC 29413中確定了shinorine 合成酶基因簇全長(6.5 kb), 包含了4個 ORFs, 分別負責編碼脫氫醌合成酶(DHQS),甲基轉移酶(O-MT), ATP-grasp和NRPS-like酶, 其中 DHQS是合成途徑的關鍵酶, 負責催化 3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸生成3-Dehydroquinate[7,8]。MAAs合成分子機制的揭示為 MAAs基因快速檢測提供了可能。

圖1 兩種代表性MAAs (shinorine and porphyra-334) 的結構圖Fig. 1 Structures of representative MAAs (shinorine and porphyra-334)

目前已報道含有MAAs的藍藻有20多個屬, 雖然它們分布廣泛, 但不同種類的藍藻MAAs差異較大[5,9]。Singh對 A. variabilis PCC 7937和 Synechocystis sp. PCC 6803研究發現, 前者能產生MAAs, 而后者卻不產[7]。盡管首先在 A. variabilisATCC 29413中揭示了MAAs合成酶的基因簇全長,但通過對 GenBank的數據分析發現, 魚腥藻相關MAAs數據較少, 這也許是導致魚腥藻屬內編碼DHQS的基因mysA差異較大的原因。不同種屬間含有的MAAs類型也不盡相同。Sinha等[10]對3株絲狀固氮藍藻進行了研究, 發現它們僅僅含有shinorine這一種類型的MAAs物質; 我國學者對微囊藻屬的銅綠微囊藻調查發現, 其含有兩種類型的MAAs, 即shinorine和porphyra-334[11], 但對于我國常見魚腥藻水華種類所含有 MAAs情況還鮮有報道。水華魚腥藻(新近的分類學研究將浮游類魚腥藻屬名Anabaena改為Dolichospermum[12])是水華藍藻中常見種類, 分布廣泛, 我國三湖均有分布。本研究通過對水華魚腥藻MAAs合成中編碼關鍵酶DHQS的mysA基因進行特異引物設計, 同時用HPLC檢測了其含有MAAs的類型, 為水華魚腥藻的生態適應性研究提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 藻株及培養

實驗所用藻株為分離自太湖的水華魚腥藻, 保存于中國科學院水生生物研究所有害藻類學科組藻種庫(CHAB), 培養條件: CT培養基, 光照強度為25 μE/(m2·s), 光周期為 12h∶12h (L∶D), 溫度為(25±1)℃。

1.2 藻株DNA提取、引物設計與mysA基因擴增

藻株基因組DNA提取方法參考Li 等[13]的方法。通過對GenBank中已報道的Anabaena sp. 90、A. variabilis ATCC 29413、Nostoc punctiforme PCC 73102、Nostoc sp. PCC 7524中DHQS同源蛋白進行Blast, 定位其核酸序列, 運用 Primer 5.0軟件進行mysA基因引物設計, 正向引物為mysaF (5′-TAACC AATTCATTTCCACAG-3′), 反向引物為 mysaR (5′-TCTCAACTCAGAAGTCAAGG-3′)。PCR反應體系為50 μL, 包含5—10 ng 模板DNA, 1U Taq DNA聚合酶(Takara, Japan), 10×PCR反應緩沖液 2 μL, 1.5 mmol/L MgCl2, 引物各10 pmol, 200 μmol/L 牛血清蛋白和200 μmol/L dNTPs (deoxyribonucleoside triphosphate), 其余用雙蒸水補足。反應體系于 MJ Mini BioRad PCR儀(BioRad, USA)上擴增, 擴增條件為: 94℃預變性3min; 94℃變性30s, 50℃退火30s, 72℃延伸 1min, 35個循環; 72℃延伸10min。經過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 將PCR產物進行切膠回收(Biospin膠回收試劑盒), 回收后的DNA連接到載體pMD18-T(Takara, Japan)上, 然后克隆載體轉化至感受態細胞E. coli Competent Cells DH5α (Takara, Japan)中, 挑取單克隆菌液送北京華大基因科技有限公司進行測序。

1.3 序列測定及系統分析

測序獲得并經人工校正的序列數據與 GenBank獲得的外源數整合后利用CLUSTAL X (version 2.0)進行對位排列[14]。然后運用分子進化遺傳分析軟件MEGA 4 program package基于Kimura two-parameter模型構建鄰接法分子系統關系樹(Neighbor-Joining tree, 簡稱NJ tree), 步展值(Bootstrap value)設置為1000, 空位或缺失位點均當作配對刪除(Pairwise deletion)處理[15]。

1.4 藻株MAAs的化學測定

取5 mL藻液, 富集后, 用25%甲醇在45℃條件下萃取3次, 取2 mL樣品的甲醇萃取液, 在45℃條件下干燥, 溶入200 μL蒸餾水, 通過0.2 μm濾膜后進行反相高效液相色譜分析(SSI HPLC 1500, USA),色譜柱 Grace Prevail C18規格 5 μm, 4.6 mm× 250 mm。流動相為25%的甲醇加0.2%乙酸, 檢測波長 250—450 nm。標樣為中國科學院水生生物研究所有害藻類實驗室制備, 提取藻株為 Microcystis aeruginosa PCC 7806。

2 結果

2.1 水華魚腥藻mysA基因擴增及系統樹分析

通過PCR檢測我們得到了一株含有mysA基因片段的藻株(D. flos-aquae CHAB1629), 克隆測序后得到約 859 bp的目的片段, 通過在 GenBank中對DHQS酶同源蛋白分析, 進一步確定了其為編碼此蛋白的 mysA基因片段。目前, 數據庫中藍藻相關mysA數據較少, 本研究對GenBank和EMBL兩大數據庫中完成全基因組測序的 12株念珠藻科藻株進行mysA數據挖掘, 以M. aeruginosa PCC 7806為外類群構建了NJ系統樹(圖2), 結果表明, mysA基因在念珠藻科內部變異較大, Cylindrospermum stagnale PCC 7417、Nodularia spumigena CCY9414、Nostoc punctiforme PCC 73102、Nostoc sp. PCC 7524、A. variabilis ATCC 29413、Anabaena sp. 90這5株藻mysA基因最大相似度僅為82%, 而同為魚腥藻屬的A. variabilis ATCC 29413和Anabaena sp. 90其mysA基因最大相似度僅為53.6%。本研究分離的D. flos-aquae CHAB1629與 Anabaena sp. 90及Aphanizomenon flos-aquae NIES-81間的最大相似度分別為99%和97.2%。

2.2 水華魚腥藻中含有MAAs物質的HPLC檢測

對含有 mysA基因片段的藻株 D. flos-aquae CHAB1629進行了HPLC化學檢測, 通過與標樣的的保留時間比較分析, 鑒定了本藻株含有的 MAAs的類型為shinorine(圖3)。

圖2 基于mysA 基因序列的NJ分子系統樹 (節點處的數字代表1000重復步展值的百分數, 低于50% 的未顯示)Fig. 2 The phylogenetic tree (NJ) based on mysA sequences (The numbers at each node represented the percentage of bootstrap setting as 1000, only showing those above 50%)

圖3 MAAs的HPLC檢測Fig. 3 MAAs detection by HPLC

3 討論

在長期的自然進化與選擇過程中, 生物有機體形成了多種應對環境變化的保護機制, 如部分生物在體內合成和積累MAAs來抵抗紫外線的損傷, 便是這些機制中較為重要的一種。藍藻作為地球上較早出現的原核生物, 同樣具有合成 MAAs的能力,不僅如此, 藍藻體內具有紫外吸收的物質還有偽枝藻素(Scytonemin)、類胡蘿卜素(Carotenoids)、糖苷蝶呤(Biopterin glucoside)等[9,16]。雖然MAAs的化學結構和抗紫外特性很早就被認識, 然而其生物合成及其分子機制直到最近才被揭示。通過對A. variabilis ATCC 29413研究, 發現了編碼MAAs的4個基因(mysA、B、C、D), 分別編碼 DHQS、O-MT、ATP-grasp和NRPS-like 4個酶, 并且發現A. variabilis ATCC 29413與Nostoc punctiforme ATCC 29133中MAAs合成基因中的前3個較為保守, 而第4個基因編碼的酶為 NRPS-like或者 D-Ala D-Ala ligase-like, 并且這兩種藍藻含有的 MAAs均為shinorine。然而并非所有藍藻均含有相同的MAAs、Nodularia baltica、Nodularia harveyana和Nodularia spumigena 3種節球藻所含 MAAs為 shinorine和porphyra-334[16,17], 有些藍藻卻不含有 MAAs, 如Synechocystis sp. PCC 6803 和 Synechococcus sp. PCC 6301。有關微囊藻中 MAAs的檢測已有報道,而對于另一種藍藻水華群體—水華魚腥藻的研究較少。本研究針對水華魚腥藻群體, 設計了檢測其mysA基因的引物, 并且對其片段進行擴增和系統分析, 發現水華魚腥藻 mysA基因片段與預想情況并不相同, 其編碼區域差異較大, 這也許跟數據量有關。通過對GenBank和EMBL中報道的念珠藻科的12株全基因組進行分析, 構建系統樹, 發現我國的水華魚腥藻D. flos-aquae CHAB1629與Anabaena sp. 90較為相近, 而與 A. variabilis ATCC 29413、Anabaena cylindrica PCC 7122和Anabaena sp. PCC 7108差異較大。推測可能的原因有兩種: 一是在魚腥藻屬內部基于 mysA基因確實分為幾個類群, 二是由于序列數據較少, 并且是通過同源蛋白比對后預測片段, 僅有少數藻株被化學驗證可產生 MAAs,而其他藻株是否能夠產生MAAs, 還需要化學驗證。因此通過基因的初步篩查和化學檢測, 才能較為準確的判定藻株含有MAAs情況。同時, 結合化學方法, 本研究檢測了 D. flos-aquae CHAB1629含有MAAs的類型(shinorine), 這與先前報道的我國銅綠微囊藻所含有的MAAs類型較為相似。但推測本藻株含有的類型不止一種(可能含有 porphyra-334)這需要獲取標準品進一步研究。由于本研究中的藻株較少, 還不能代表眾多浮游魚腥藻類群的情況, 因此需要大量分離我國野外水體中不同種類的魚腥藻進行深入研究, 評估其產MAAs能力及其對環境的適應性。本研究結果可為后續浮游類魚腥藻 MAAs的分子鑒定提供參考。

[1] Balskus E P, Walsh C T. The genetic and molecular basis for sunscreen biosynthesis in cyanobacteria [J]. Science, 2010, 329(5999): 1653—1656

[2] Rosic N N. Phylogenetic analysis of genes involved in mycosporine-like amino acid biosynthesis in symbiotic dinoflagellates [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 94(1): 29—37

[3] Nazifi E, Wada N, Yamaba M, et al. Glycosylated porphyra-334 and palythine-threonine from the terrestrial cyanobacterium Nostoc commune [J]. Marine Drugs, 2013, 11(9): 3124—3154

[4] Miyamoto K T, Komatsu M, Ikeda H. Discovery of gene cluster for mycosporine-like amino acid biosynthesis from Actinomycetales microorganisms and production of a novel mycosporine-like amino acid by heterologous expression [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(16): 5028—5036

[5] Chen X L, Deng G B, Liu K Q, et al. UV-protective metabolites in aquatic organisms——mycosporine-like amino acids [J]. Chinese Bulletin of Botany, 2006, 23(1): 78—86 [陳小蘭, 鄧國賓, 劉開慶, 等. 水生生物的紫外光防護劑——類菌胞素氨基酸. 植物學通報, 2006, 23(1): 78—86]

[6] Shick J M, Romaine-Lioud S, Ferrier-Pagès C, et al. Ultraviolet-B radiation stimulates shikimate pathway dependent accumaltion of mycosporine-like amino acids in the coral Stylophora pistillata despite decreases in its population of symbiotic dinoflagellates [J]. Limnology and Oceanography, 1999, 44(7): 667—1682

[7] Singh S P, Klisch M, Sinha R P, et al. Genome mining of mycosporine-like amino acid (MAA) synthesizing and non-synthesizing cyanobacteria: A bioinformatics study [J]. Genomics, 2010, 95(2): 120—128

[8] Singh S P, Klisch M, Sinha R P, et al. Sulfur deficiency changes mycosporine-like amino acid (MAA) composition of Anabaena variabilis PCC 7937: A possible role of sulfur in MAA bioconversion [J]. Photochemistry and Photobiology, 2010, 86(4): 862—870

[9] Gao H Y. The studies on UV-absorbing compounds MAAs in Microcystis strains from China [D]. Thesis for Master of Science. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan. 2014 [高合意. 微囊藻中紫外吸收物質類菌胞素氨基酸(MAAs)的研究. 碩士學位論文, 中國科學院水生生物研究所, 武漢. 2014]

[10] Sinha R P, Klisch M, Walter Helbling E, et al. Induction of mycosporine-like amino acids (MAAs) in cyanobacteria by solar ultraviolet-B radiation [J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 2001, 60(2—3): 129—135

[11] Liu Z W, Zhong P, Han B P. UV Protective compounds mycosporine-like amino acids (MAAs) and bloom forming mechanism in Microcystis aeruginosa [J]. Journal of Lake Sciences, 2003, 15(4): 359—363 [劉正文, 鐘萍, 韓博平.銅綠微囊藻中的紫外保護物質類菌孢素氨基酸(MAAs)與水華形成機制探討. 湖泊科學, 2003, 15(4): 359—363]

[12] Wacklin P, Hoffmann L, Komárek J. Nomenclatural validation of the genetically revised cyanobacterial genus Anabaena (Ralfs ex Bornet et Flahault) comb. nova [J]. Fottea, 2009, 9(1): 59—64

[13] Li R H, Wilhelm S W, Carmichael W W, et al. Polyphasic characterization of water bloom forming Raphidiopsis species (cyanobacteria) from central China [J]. Harmful Algae, 2008, 7(2): 146—153

[14] Larkin M, Blackshields G, Brown N, et al. Clustal W and Clustal X version 2.0 [J]. Bioinformatics, 2007, 23(21): 2947—2948

[15] Posada D, Crandall K. Modeltest: testing the model of DNA substitution [J]. Bioinformatics, 1998, 14(9): 817—818

[16] Hu C L. Development of a rapid method for microcystin analysis and construction of Microcystis aeruginosa PCC 7806 mutants bearing deficiency in the biosynthesis of mycosporine-like amino acids [D]. Thesis for Doctor of Science. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan. 2011 [胡臣林. 微囊藻毒素快速分析方法建立和銅綠微囊藻PCC 7806類菌孢素氨基酸生物合成缺陷突變體的構建. 博士學位論文, 中國科學院水生生物研究所, 武漢. 2011]

[17] Sinha R P, Ambasht N K, Sinha J P, et al. UV-B-induced synthes is of mycosporine-like amino acids in three strains of Nodularia (cyanobacteria) [J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 2003, 71(1): 51—58

IDENTIFICATION AND DETERMINATION OF MYCOSPORINE-LIKE AMINO ACIDS (MAAS) IN DOLICHOSPERMUM FLOS-AQUAE

LIU Yang1, GAO He-Yi2, LI Xiao-Yu1and LI Ren-Hui2
(1. College of Life Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China; 2. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

Mycosporine-like aminoacids (MAAs) exist in cyanobacteria, fungi, and eukaryotic micro- and macro-algae. They absorb ultraviolet (UV) and hence protect these organisms from the damages caused by the environmental UV radiation. The understanding of the biosynthetic pathway and the genetic properties of MAAs is fundamental for the fast-detection of MAAs genes. In the present study, we amplified the partial coding sequence of the gene encoding DHQS enzyme in Dolichospermum flos-aquae CHAB1629 that was isolated from the Taihu Lake. The nucleotide similarity between D. flos-aquae CHAB1629 and Anabaena sp. 90 was 99%, and it was only 53.6% between D. flos-aquae CHAB1629 and Anabaena variabilis ATCC 29413. High-performance liquid chromatography (HPLC) assays confirmed that MAAs in D. flos-aquae CHAB1629 were shinorine.

Cyanobacteria; Dolichospermum flos-aquae; MAAs; HPLC

Q943.2

A

1000-3207(2015)03-0549-05

10.7541/2015.72

2014-06-24;

2014-11-25

國家自然科學基金青年基金(31400395); 國家博士后科學基金(2014M552006); 河南省科技廳國際合作項目(144300510046); 河南師范大學博士基金(qd13034)資助

劉洋(1983—), 男, 河南新鄉人; 講師; 主要從事藍藻分子生態學研究。E-mail: liuyang6368@126.com

李仁輝(1965—), 研究員; 主要從事藍藻分類系統以及藻類環境生物學研究。E-mail: reli@ihb.ac.cn