耐高溫飼用酵母菌種的篩選

劉宇峰，王玥明，楊慶麗，姬妍茹，董 艷，石 杰

(黑龍江省科學院大慶分院，黑龍江大慶 163319)

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耐高溫飼用酵母菌種的篩選

劉宇峰，王玥明，楊慶麗，姬妍茹，董 艷，石 杰

(黑龍江省科學院大慶分院，黑龍江大慶 163319)

[目的]篩選出可適于配合型生物飼料高溫加工需要的酵母菌株。[方法]通過對國家允許使用的酵母菌6株進行高溫損傷耐受性試驗和高活性培養條件的研究。[結果]篩選到可耐受45 ℃高溫并保持108個/ml的高活菌數的菌株2株DQFC2117-1和DQFC2122-2。[結論]篩選出的菌株DQFC2117-1和DQFC2122-2可作為配合型生物飼料加工所需要的耐高溫酵母菌株。

耐高溫；飼用酵母；配合型；生物飼料

我國目前企業生產的酵母生產工藝從初期的吸附法的壓榨酵母(含水量20%)到20世紀80年代的氣流干燥普通活性干酵母(含水量8%)，至目前的快速低溫干燥技術的速效活性干酵母(含水量4%～5%)，均屬于真空包裝的活性干酵母類型[1]。因此，尚無法突破飼料行業在生物飼料的配合型終端生物飼料產品的粗放性的加工、造粒所遭受的機械損傷及粗放保存、長途運輸和粗放使用而導致的活力損傷的技術瓶頸，這些產品往往在加工過程中其生物活性就幾乎全部損失[2]，因此在很大程度上限制了活性酵母在生物飼料領域的應用和拓展。因此，可耐受粗放條件的飼用活性酵母產品的技術研發問題就被客觀地突顯出來。筆者選育出高活性和耐高溫的飼用酵母菌種，以期為今后研究高活性、耐高溫、耐造粒、耐貯運的直投式飼用酵母添加劑新產品奠定重要的菌種基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種。飼用酵母菌DJ-1，分離自大連興和飼用活性干酵母產品；產朊假絲酵母，由黑龍江省科學院微生物所惠贈； 釀酒酵母，由東北農業大學食品學院惠贈； 釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeAS2.300 FFCC2117和FFCC2167、 產朊假絲酵母Candidautilis,AS2.1028 FFCC2122，均由大連工業大學惠贈。

1.1.2培養基。馬鈴薯培養基、察氏培養基、麥芽汁培養基、豆芽汁培養基；其他化學試劑均為國產化學純。馬鈴薯和大豆均采用東北優質材料。

1.2 儀器數顯電熱培養箱，型號HPX—9082MBE，為上海博迅實業有限公司醫療設備廠產品；振蕩培養箱，型號HZQ—X100，為哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司產品；生物安全柜，型號BSC-1360ⅡA2，為北京東聯哈爾儀器制造有限公司產品；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，為型號LDZX—40SCI，為上海申安醫療儀器廠產品；生物顯微鏡，型號BK-5000，為重慶奧特光學儀器有限公司產品；紫外可見分光光度計，型號UV-759，為上海精密科學儀器有限公司產品；酸度計，為上海精密科學儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1純化與分離。將已收集的6株飼用酵母采用麥芽汁瓊脂平板法28 ℃下培養24 h，進行菌種純化。對具有酵母典型性形態的單菌落進行觀察；以無菌水洗下斜面培育的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液， 取0.05%美藍染色液1滴，置于載玻片中央，并用接種環取酵母菌懸液與染色液混勻，染色2～3 min，加上蓋玻片，置于高倍鏡下觀察酵母菌個體形態，進行顯微鏡檢定。最后，將具有典型性的單菌落劃線至麥芽汁固體斜面培養基上保存備用[3]。

1.3.2適宜培養基的初步篩選。將已純化分離出的6株飼用酵母斜面菌分別接種于馬鈴薯培養基、察氏培養基、麥芽汁培養基和豆芽汁培養基4種酵母常用的液體培養基上，28 ℃下培養24 h，以平板計數法檢測酵母的活菌數為指標，確定各菌株適宜的培養基。

1.3.3耐高溫酵母菌株的菌種誘變及篩選。將培養好的6株酵母斜面作為出發菌株，進行Co60放射物理誘變，照射劑量為3 000 Gy。將誘變后的斜面菌全部洗脫至各菌株適宜的液體培養基中，以出發菌株為對照，分別于40、45和50 ℃震蕩培養24 h，采用平板法篩選出生長較旺盛的酵母菌株，劃入各菌株適宜的斜面培養基， 4 ℃下保存。

2 結果與分析

2.1 飼用酵母菌種的分離與純化通過對6株飼用酵母在麥芽汁瓊脂平板法上的單菌落形態的觀察和顯微鏡檢定，分離出菌落飽滿、生長快且具有酵母典型性形態的菌株各2株。

從表1可以看出，所收集的6株菌株菌符合酵母菌的典型特性，并經純化后獲得了12株酵母純菌株。

表1 分離純化出的飼用酵母菌株的菌落特征

2.2 適宜的酵母培養基篩選將6株酵母分別純化出的菌株6株按1%接種量分別接種于100 ml馬鈴薯培養基、察氏培養基、麥芽汁培養基和豆芽汁培養基4種酵母常用液體培養基中，28 ℃ 震蕩培養24 h 后，分別采用平板活菌數計數法測定酵母菌的生成量，以確定培養基的適宜情況。

從表2可以看出，飼用酵母DQDJ-1較適宜的培養基為馬鈴薯培養基和麥芽汁培養基；產朊假絲酵母DQCR-1 較適宜的培養基為馬鈴薯培養基和察氏培養基；釀酒酵母DQDN-2 適宜的培養基是麥芽汁培養基；產朊假絲酵母DQFC2122-1和釀酒酵母DQFC2117-1適宜的培養基都是馬鈴薯培養基； 釀酒酵母DQFC2167-1適宜的培養基為馬鈴薯培養基和麥芽汁培養基。

表2 6株酵母在不同液體培養基中的活菌數 CFU/ml

注：**表示差異極顯著(P<0.01)；*表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 耐高溫酵母菌株的菌種誘變及篩選將經過劑量3 000 Gy的Co60放射物理誘變的6株酵母，以出發菌株為對照，分別經40、45、50 ℃培養24 h的高溫條件篩選后，采用平板法測定存活的菌數，并經誘變前后方差分析后,篩選出可以顯著耐受高溫的酵母菌株。

從表3可以看出，經過誘變后DQFC2117-1和DQFC2122-1菌株在馬鈴薯培養基上存活的菌落數與出發對照株相比有顯著性提高，可以耐受45 ℃的培養溫度。2株菌株光學及電子顯微鏡下的細胞形態見圖1～4。

表3 可耐高溫生長的酵母菌株的活菌數 CFU/ml

注：**表示差異極顯著(P﹤0.01)；*表示差異顯著(P﹤0.05)，-表示無生長。

3 結論與討論

該研究以具有提高含脂量和生香味的釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeAS2.300 FFCC2117和可提高蛋白含量的食用及飼料酵母-產朊假絲酵母CandidautilisAS2.1028 FFCC2122為出發點菌株，通過誘變和篩選，得到2株可耐受45 ℃的高培養溫度的菌株DQFC2117-1、DQFC2122-1，突破了以前作為飼料工業允許使用的釀酒酵母和產朊假絲酵母的25～28 ℃液體培養的經典培養模式，為今后進一步研究耐高溫、耐造粒、耐貯運的高活性直投式飼用酵母添加劑新產品奠定了重要的耐高溫菌種的研究基礎。

微生物廣泛存在于自然界，至今已發現大量極端微生物，如極端嗜鹽菌和極端嗜酸、嗜熱的菌[4]。嗜熱微生物(Thermophiles)是一種能在高于40～50 ℃溫度下生長 ，最適生長溫度為55～65 ℃，最高生長溫度80 ℃的微生物。發酵工業中應用的德氏乳酸桿菌的最適生長溫度為45～50 ℃，嗜熱糖化芽孢桿菌為65 ℃。關于嗜熱微生物能在高溫環境中生存的原因，有人認為是胞內酶和蛋白質分子中1個或多個部位被某些氨基酸所取代，能以特殊的方式折疊，導致抵抗溫度的變性作用胞內酶和蛋白質在高溫時更穩定。另外，細胞質膜富含飽和脂肪酸，因而膜在高溫下仍很穩定并發揮功能。tRNA在特定的堿基區域含較多GC對，使其核酸有熱穩定性的結構。但是，以前研究的嗜熱微生物大部分為細菌，常見于溫泉、熱泉、火山噴氣口、海底火山噴氣口、堆肥，在食品發酵工業應用中較為少見。2011年徐大鵬等[5]在乙醇發酵的菌中篩選到1株可在41 ℃下良好生長的耐高溫產酒精酵母菌，證實了耐高溫酵母菌的真實存在，也為該研究提供了耐高溫飼用酵母菌篩選成功的有力佐證。該研究可為今后耐高溫酵母菌在生物飼料及其他應用領域的廣泛應用提供理論依據。

[1] 張建峰,耿宏偉,王丕武.釀酒活性干酵母生產工藝優化及干燥劑的選擇[J].食品科學，2011(9):213-216.

[2] 胡彬.活性干酵母行業發展瓶頸與對策[J].中國食品工業，2006(7):20-21.

[3] 于景芝.酵母生產與應用手冊[M].北京:中國輕工業出版社，2005:20-400.

[4] 沈萍.微生物學[M].北京：高等教育出版社，2000:1-30.

[5] 徐大鵬,李云杰,張栩,等.耐高溫酵母菌的篩選及特性[J].生物加工過程，2011(3):17-21.

Screening of High Temperature Resistant Forage Yeast Strains

LIU Yu-feng, WANG Yue-ming, YANG Qing-li et al

(Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences, Daqing, Heilongjiang 163319)

[Objective] To filter out yeast strains adapt to fit the need of biological feed with high temperature processing. [Method] By using yeast to the state allows the use of 6 lines to study condition and high temperature damage tolerance culture experiment in high activity. [Result] DQFC2117-1 and DQFC2122-2 obtained can withstand high temperature of 45 ℃ and the high number of live cells108 cfu/ml strains. [Conclusion] The screened strains DQFC2117-1 and DQFC2122-2 can be used as strain yeast for biological feed processing.

High temperature resistance; Feed yeast; Fit type; Biological feed

黑龍江省財政廳基本應用技術研究專項。

劉宇峰(1963-)，女，遼寧丹東人，研究員，從事微生物飼料研究。

2014-11-19

S 816.6

A

0517-6611(2015)02-086-02