針刺對老年大鼠腹部手術后海馬CA1區神經元細胞凋亡的影響※

徐少群 曾素冰 趙高峰 方素娟 黃祥凌 高巨

（廣東省中醫院麻醉科，廣東廣州 510120）

術后認知功能障礙（postoperation cognitive dysfunction，POCD）是患者在全麻術后出現的中樞神經系統并發癥，常見于接受大手術、急診手術后的老年患者，表現為手術后數天至數周出現記憶力、精神集中能力、語言理解力受損，社會適應能力下降，甚至可發展為永久性認知障礙，喪失獨立生活能力［1］。本課題組前期研究表明，針刺可明顯改善老年患者腸癌切除POCD的發生［2］。為進一步探討針刺對中樞神經的作用機制，我們觀察了針刺對老年大鼠腹部手術后海馬CA1區神經元凋亡的影響，結果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物20月齡無特定病原體（SPF）級老年SD大鼠30只，雌雄各半，體質量550～640 g，由長沙天勤生物技術有限公司提供，動物許可證編號:SCXK（湘）2009-0012。

1.1.2 主要儀器及試劑英迪KWD-808Ⅰ型微電腦脈沖針灸治療儀（常州英迪電子醫療器械有限公司）;TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒、蛋白酶K（南京建成生物工程研究所）;水合氯醛（美國Sigma公司）;鹽酸布比卡因注射液（上海禾豐制藥有限公司，國藥準字H31022840）;華佗牌15 mm×0.26 mm毫針（蘇州醫療用品廠有限公司）;多聚甲醛（上海碧云天生物技術有限公司）;Olympus光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組將30只大鼠隨機分為5組:空白對照組（以下簡稱C組）、術后1 d處死組（以下簡稱S1組）、術后3 d處死組（以下簡稱S3組）、聯合針刺術后1 d后處死組（以下簡稱A1組）及聯合針刺術后3 d處死組（以下簡稱A3組），每組各6只。

1.2.2 操作方法C組不予任何干預措施;S1組及S3組按照Wan Y等［3］報道方法開腹行脾切除術，具體步驟:予大鼠腹腔內注射10%（W/V）水合氯醛（0.25 mL/100 g）麻醉后，將大鼠固定于手術臺，手術切口處備皮、消毒，以0.25%鹽酸布比卡因注射液局部浸潤麻醉，在上腹部左鎖骨中線做1.5 cm小切口，游離出脾臟，結扎脾門神經、血管后，完整切除脾臟，然后用手術縫合線逐層關腹，所有手術步驟均無菌操作。A1組及A3組于麻醉前20 min取百會、印堂行針刺，選用15 mm ×0.26 mm毫針，連接微電腦脈沖針灸治療儀，采用疏密波，頻率2/15 Hz，電針強度為引起局部肌肉微顫動，20 min后進行再行開腹脾切除術操作，電針刺激持續至手術操作完畢。大鼠穴位根據中國針灸學會實驗針灸研究會制訂的《動物針灸穴位圖譜》進行選擇。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 標本采集及制作S1組及A1組大鼠于術后1 d腹腔注射10%（W/V）水合氯醛（0.4 mL/kg）過量麻醉，C組、S3組及A3組于術后3d腹腔注射l0%（W/V）水合氯醛（0.4 ml/kg）過量麻醉，然后均經心臟灌注0.9%氯化鈉注射液200 mL后，再以4%多聚甲醛300 mL經心臟灌注固定，斷頭取腦后，分離出大鼠海馬組織，放入4%多聚甲醛常規固定24 h后，進行包埋切片。

1.3.2 檢測方法采用TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒檢測海馬CA1區神經元凋亡情況。具體步驟如下:按常規方法將石蠟切片進行脫蠟及水合，將處理好的樣本浸入磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次，每次5 min，然后加入蛋白酶K工作液（2 μL蛋白酶K+98 μL PBS），21～37℃作用15～30 min，再將樣本浸入PBS漂洗3次，每次5 min，處理好樣本后浸入封閉液（3%雙氧水甲醇溶液）中，室溫（15～25℃）封閉10 min后浸入PBS漂洗2次，每次5 min，然后進行標記和顯色反應。每張切片在海馬CA1區隨機選3個視野，于光學顯微鏡（×200）下攝片，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析凋亡細胞光密度值。

1.4 統計學方法采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，行單因素方差分析及LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.15 組大鼠海馬CA1區神經元細胞凋亡檢測結果光鏡下C組海馬CA1區神經元細胞未見明顯染色（見封3，圖1）;S1組可見大量凋亡細胞體積縮小，凋亡小體呈黑色或紫藍色位于細胞核內（見封3，圖2）;S3組（見封3，圖3）及A1組（見封3，圖4）亦可見中量呈灰黃色的凋亡細胞; A3組可見少量凋亡細胞（見封3，圖5）。

2.25 組大鼠海馬CA1區神經元凋亡光密度值比較見表1。

表15 組大鼠海馬CA1區神經元凋亡光密度值比較±s

表15 組大鼠海馬CA1區神經元凋亡光密度值比較±s

組別n 神經元凋亡光密度值C組0.212±0.068 S1組62.991±0.217 S3組62.182±0.339 A1組61.462±0.175 A3組6 6 0.456±0.073

表1數據經單因素方差分析，與C組比較，S1組、S3組、A1組及A3組海馬CA1區神經元凋亡光密度值均明顯升高（P＜0.05），且S1組升高最明顯（P＜0.05）;與S1組及S3組比較，A1組及A3組海馬CA1區神經元凋亡光密度值均明顯降低（P＜0.05），且A3組下降最明顯（P＜0.05）。

3 討論

POCD是老年患者手術后常見的神經系統并發癥，在非心臟手術后1周內發病率高達25.8%～48.6%［1］。目前，隨著社會老齡化的加劇，多數老年人在其余生至少會接受1次手術，而POCD不僅延長患者住院時間，增加術后死亡率，嚴重危害老年患者術后身心健康恢復，更進一步加重了家庭及社會醫療保障體系的負擔。因此，采取積極措施防治POCD有著十分重要的臨床和社會意義，并已成為全世界關注的熱點課題。但迄今為止，國內外對POCD的研究才剛剛起步，其現代醫學發病機制尚不十分清楚，更缺乏有效防治策略［4］。為尋找安全有效的防治方案，本課題根據長期從事圍手術期重大疾病防治工作的經驗，并結合中醫經絡學說理論特點，發現針刺在多種缺血缺氧性腦病所致認知功能障礙中具有良好防治效果，并積極開展探索圍手術期進行針刺干預對防治POCD的作用，取得了確切療效［5］。

為進一步探討針刺中樞神經系統的作用機制，本實驗選取了百會及印堂兩穴位對老年腹部手術大鼠進行術前干預。針刺百會可調督脈，提升陽氣，開竅啟閉，醒神安神;印堂雖屬經外奇穴，但其位于督脈循行路線之上，故針刺印堂可推動督脈氣血運行，可治督脈所過部位病癥，有凝神定志、開竅醒神通絡的功效。有實驗研究表明，督脈電針刺激可改善腦部缺血，直接作用于腦神經，使機體血氧重新分配，以保護腦組織［6］，這種保護機制在于針刺能增加大鼠皮質和海馬神經元Bcl -2蛋白表達，降低Bax蛋白表達，抑制神經元凋亡和壞死，保護缺血損傷后的皮質和海馬神經元，從而改善大鼠的學習記憶功能［7］。本實驗結果也表明，腹部手術可導致大鼠海馬CA1區神經元凋亡，并持續至術后3 d仍處于較高水平，但通過術前及術中電針針刺持續干預后，大鼠海馬CA1區神經元凋亡水平在術后1 d即明顯下降，至術后3 d僅有少量細胞凋亡。

綜上所述，手術創傷可引發海馬神經元凋亡，針刺可抑制大鼠海馬CA1區神經元凋亡，對神經細胞起保護作用，這可能是針刺防治POCD的作用機制之一。

［1］Moller JT.Postoperative cognitive decline:the extent of the problem［J］.Eur J Anaesthesiol，1998，15（6）:765 -767.

［2］林舜艷，尹正錄，高巨，等.針刺麻醉對老年患者腸癌切除術后認知功能障礙影響及其S-100β蛋白的變化［J］.中國針灸，2013，33（1）:63-66.

［3］Wan Y，Xu J，Ma D，et al.Postoperative impairment of cognitive function in rats:a possible role for cytokinemediated inflammation in the hippocampus［J］.Anesthesiology，2007，106（3）:436-443.

［4］林舜艷，高巨.老年患者術后認知功能障礙研究新進展［J］.廣東醫學，2010，31（2）:243-244.

［5］林舜艷，戴載深，高巨，等.老年患者腸癌切除術后早期認知功能障礙的危險因素［J］.中華麻醉學雜志，2011，31（11）:1320-1322.

［6］李真姬，田貴華，黃長軍，等.督脈電針對顱腦損傷大鼠48h后差異蛋白組學的機理研究［J］.云南中醫中藥雜志，2010，31（9）:61-62.

［7］李敏，徐國峰.電針對血管性癡呆大鼠海馬神經元凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和HO-1的影響［J］.中華中醫藥雜志，2006，21（8）:502-504.

（本文編輯:石康）