奧硝唑對映體對小鼠中樞抑制作用的機制探究*

魏婷婷，孫繼紅，韓璐薇，王志強，季 暉**

1中國藥科大學藥理教研室，南京 210009；2南京圣和藥業股份有限公司，南京 210038

奧硝唑對映體對小鼠中樞抑制作用的機制探究*

魏婷婷1，孫繼紅1，韓璐薇2，王志強2，季 暉1**

1中國藥科大學藥理教研室，南京 210009；2南京圣和藥業股份有限公司，南京 210038

目的：探討右奧硝唑中樞抑制效應與腦內γ-氨基丁酸（gamma amino butyric acid，GABA）系統的關系。方法：經不同劑量右/左奧硝唑處理后使用N，N-二甲基二吖啶硝酸鹽（1-（Ethoxycarbonylmethyl）-6-methoxyquinolinium bromide，MQAE）熒光探針檢測原代培養小鼠皮層神經元氯離子濃度，并通過western blot方法檢測GABAA受體亞基的表達。尾靜脈注射給予右/左奧硝唑后測定小鼠高架十字迷宮行為。結果：右奧硝唑劑量依賴性激活小鼠皮層神經元的氯離子通道，經右奧硝唑處理后的皮層神經元能增加GABAA受體α1亞基的水平，且右奧硝唑有潛在的抗焦慮活性。結論：右/左奧硝唑中樞作用不同，右奧硝唑較強的中樞抑制作用可能與激活GABA系統有關。

右/左奧硝唑；氯離子通道；GABA系統

奧硝唑為第3代硝基咪唑類衍生物，具有良好的抗厭氧菌、抗滴蟲和抗阿米巴原蟲作用，臨床上主要用于手術前預防感染和手術后抗敏感厭氧菌。但臨床應用時會有肝損傷、腸胃不適、嘔吐、頭暈、嗜睡等消化系統和神經系統不良反應[1]。前期研究發現，在藥效學作用無顯著性差別、藥代動力學特征相似的前提下，右奧硝唑對小鼠的中樞抑制作用顯著強于左奧硝唑[2]，且右奧硝唑的中樞作用能夠在一定程度上被GABAA受體拮抗劑所阻斷。

γ-氨基丁酸 （gamma amino butyric acid，GABA）為中樞神經系統內主要的抑制性遞質。動物及人體內的GABAA受體系五聚體大分子，由5個亞單位組成，分子的中心部位形成門控氯離子通道。每一亞單位包含1個大的細胞外N末端區、3個緊密排列的穿透胞膜的部分（M1-M3）、胞漿區（M4）及一短的胞外C末端[3]。當GABA與其受體結合時，氯離子通道開放，氯離子進入細胞，導致胞內負電位增加，細胞由極化變為超極化，表現出鎮靜、抗焦慮等中樞抑制作用。

本研究采用 N，N-二甲基二吖啶硝酸鹽（MQAE）熒光探針，檢測奧硝唑對映體對原代培養小鼠皮層神經元氯離子通道的影響，并通過western blot方法檢測給藥后GABAA受體α1亞基的表達。最后采用經典高架十字迷宮實驗 （elevated plus maze，EPM）對奧硝唑對映體的抗焦慮作用進行探究，從整體動物水平佐證右奧硝唑對GABAA受體的作用。其目的為進一步揭示奧硝唑對映體產生中樞抑制作用差異的作用機制及對臨床安全用藥提供指導。

1 儀器與材料

1.1 儀器CO2恒溫培養箱（Thermo Electron）；倒置顯微鏡 （OLYMPUS）；多功能酶聯免疫熒光檢測儀（SpectraMax M3型，Molecular Device）；日立CF16RⅫ高速冷凍離心機；SDS-PAGE電泳儀（Bio-RAD）；eBlot蛋白轉移系統 （Genscript）；凝膠成像系統（Bio-RAD，美國）；彩色CCD（Bio-RAD）；自制小鼠高架十字迷宮測試儀[4]。

1.2 試劑與藥品

左奧硝唑（批號：20130904，純度99.8%）、右奧硝唑（批號：20130506，純度：99.7%），均由南京圣和藥業股份有限公司提供，溶媒為含15%丙二醇的生理鹽水注射液；γ-氨基丁酸、N，N-二甲基二吖啶硝酸鹽（MQAE）、木瓜蛋白酶、DNA酶、GABAAα1、βactin抗體均購于sigma公司；B27、DMEM培養基、胎牛血清均購于Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型，江蘇碧云天生物技術研究所）；蛋白裂解液 （Millipore，美國）；蛋白酶抑制劑混合片（Roche）；其他試劑均為市售分析純。

1.3 動物

ICR種小鼠，體重18～22 g由揚州大學比較醫學中心提供，動物合格證號：SCXK（蘇）2012-0004。

2 實驗方法

2.1 原代培養小鼠皮層神經元

孕18天的ICR小鼠脫頸椎處死，無菌條件下取出胎鼠，迅速分離前額葉皮層，置于預冷的10% FBS DMEM培養液中，去除腦膜。將組織移入新鮮培養液并剪碎，加入木瓜蛋白酶及DNA酶后，置于37℃、5%CO2培養箱中消化30 min。消化過的組織塊1000 r·min-1離心5 min后，加入適量的10%胎牛血清DMEM培養液，調整細胞密度至2.5×105個/ mL，接種于預先包被多聚賴氨酸的培養板中，放置于37℃、5%CO2培養箱中培養。4 h后更換為含2%B27的Neurobasal培養液，每48 h更換新鮮的Neurobasal培養液。

2.2 奧硝唑對映體對原代培養皮層神經元氯離子通道激活作用的測定[5]

移除原有培養基，無氯緩沖液 （20 mmol·L-1HEPES，2.4mmol·L-1K2HPO4，0.6 mmol·L-1KH2PO4，1 mmol·L-1MgSO4，1 mmol·L-1CaSO4，130 mmol·L-1NaNO3，10 mmol·L-1glucose）洗滌細胞3次后，每孔加入100 μL，使細胞在含有5 mmol·L-1MQAE的Neurobasal培養液中避光37℃孵育40 min。溫熱高氯緩沖液（130 mmol·L-1NaCl取代130 mmol·L-1NaNO3，其它成分同無氯緩沖液）洗滌細胞3次后，用SpectraMax M3熒光酶標儀，在激發波長360 nm和發射波長450 nm的條件下測量基礎熒光值F0。細胞分別經過0.2、2、20 μM右/左奧硝唑、100 μM GABA、高氯緩沖液處理后再次在激發波長360 nm和發射波長450 nm的條件下測量熒光值F。以測定時間點（trace time/second）為橫坐標、相對熒光值（relative fluorescence，F/F0）為縱坐標，作圖并進行統計學分析。

2.3 western blot檢測

分別用終濃度0.2、2、20 μM的右/左奧硝唑和10 μM地西泮處理細胞，48 h后離心收集細胞。每孔細胞加入適量的蛋白裂解液（Millipore，美國），冰上裂解10 min后收集細胞碎片及裂解液，12000 r· min-1、4℃離心10 min，取上清液，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白定量后在12%SDS-PAGE電泳條件下分離，轉染至NC膜（Millipore，美國），用5%BSA于室溫下搖床封閉膜2 h。膜在抗GABAA受體α1（1∶500 sigma）和抗β-actin抗體 （1∶4000 sigma）稀釋液中4℃孵育過夜，1×T-BST洗膜5 min，共4次后，在二抗稀釋液（α1為抗兔，β-actin為抗鼠，稀釋比例均為1∶2000，sigma）中室溫孵育1 h。再次洗膜后加入發光液反應3 min，置于凝膠成像系統曝光。

2.4 小鼠高架十字迷宮試驗（EPM）

64只雄性ICR小鼠隨機分為右奧硝唑組（10、20、40 mg·kg-1）、左奧硝唑組（10、20、40 mg·kg-1）、陰性對照組（含15%丙二醇的生理鹽水注射液）、陽性對照組（地西泮，2 mg·kg-1），每組8只，雌雄各半。給藥10 min后，小鼠置于高架十字迷宮中央平臺，使其頭部正對其中一個開放臂，釋放后即開始記錄5 min內下述指標[6]：（1）進入開放臂次數（open arm entry，OE）；（2）開放臂滯留時間 （open arm time，OT），單位為s；（3）進入封閉臂次數（close arm en try，CE）；（4）封閉臂滯留時間（close arm time，CT），單位為s。開放臂和封閉臂總的進入次數（OE+CE）反映小鼠的運動能力，開放臂滯留時間占總測定時間的百分比反映小鼠焦慮狀態。

2.5 統計學分析

3 結 果

3.1 奧硝唑對映體對原代培養小鼠皮層神經元氯離子通道的激活作用

如圖1所示，與陰性對照高氯緩沖液組相比，100 μM GABA能夠顯著降低氯離子熒光強度 （P＜0.01）。右奧硝唑呈劑量依賴性地增加原代培養小鼠皮層神經元氯離子通道開放，使胞外氯離子內流，與細胞內MQAE結合從而導致其熒光淬滅，熒光值F降低，F/F0值下降。實驗結果提示，右奧硝唑可以顯著開放原代皮層神經元上氯離子通道。而左旋奧硝唑增加原代皮層神經元氯離子通道開放的能力明顯較弱，與陰性對照組相比，僅隨劑量升高有增加胞外氯離子內流的趨勢，但所設三個劑量組與陰性對照組相比均無統計學意義（P>0.05）。

圖1 奧硝唑對映體對原代培養小鼠皮層神經元氯離子通道的影響（n=6）

3.2 奧硝唑對映體對原代培養小鼠皮層神經元GABAA受體α1亞基表達的影響

經地西泮和高劑量右奧硝唑處理后，原代培養小鼠皮層神經元的GABAA受體α1亞基上調，而左奧硝唑各劑量組均不能增加α1亞基的表達。見圖2。

圖2 奧硝唑對映體對原代培養小鼠皮層神經元GABAA受體α1亞基表達的影響（n=3）

3.3 奧硝唑對映體對小鼠高架十字迷宮行為的影響

小鼠靜脈給藥10 min后進行高架十字迷宮行為學實驗（見圖3），與陰性對照組比較，地西泮組、右奧硝唑高劑量組開臂滯留時間百分比均顯著高于對照組（P<0.01或P<0.05）。右奧硝唑中、低劑量組及左奧硝唑各劑量組間開臂滯留時間百分比則差異無統計學意義（P>0.05）。與陰性對照組比較，地西泮組和右/左奧硝唑各劑量組開放臂和封閉臂總的進入次數（OE+CE）差異均無統計學意義（數據未顯示）。

圖3 奧硝唑對映體給藥10 min后對小鼠開臂滯留時間百分比的影響（n=8）

4 討 論

GABAA受體是配體門控離子通道超家族成員之一，由5個亞基組成五邊形異質多肽寡聚體，中心部位形成門控氯離子通道。哺乳類動物大腦中突觸型GABAA受體主要是由α、β和γ亞基組成。神經藥理學的研究表明，GABAA受體含有GABA識別位點、地西泮識別位點和巴比妥識別位點等。配體能通過直接開放氯離子通道或增加氯離子通道開放頻率、時間等途徑增加胞內氯離子濃度，使細胞超極化而產生抑制作用。原代培養小鼠皮層神經元培養7天后表達功能性GABAA受體[7]，可用于評價藥物是否會引起胞內氯離子濃度改變。N，N-二甲基二吖啶硝酸鹽（MQAE）熒光探針以溴離子為配對陰離子，最大激發波長約為360 nm，最大發射波長約為450 nm[8]。MQAE是使用最廣泛的一種新型氯離子熒光探針。MQAE以氯離子為配對陰離子，當氯離子濃度升高時，MQAE的熒光強度隨著氯離子濃度的增加而成比例地減少。

本研究結果顯示，GABA能顯著開放氯離子通道，在該測定條件下使熒光強度大幅度下降，右奧硝唑也可降低熒光強度，且呈一定的劑量依賴性，左奧硝唑各劑量組均無明顯影響。因此，右奧硝唑中樞抑制作用的產生可能與激活GABAA受體、開放氯離子通道有關。應用western blot進一步研究表明，右奧硝唑和地西泮都能增加原代小鼠皮層神經元GABAA受體α1亞基的表達，因此，右奧硝唑可能作用于GABAA受體而抑制神經元興奮，最后產生鎮靜、抗焦慮等中樞抑制效應。

高架十字迷宮是抗焦慮研究中應用最廣泛的模型之一，反映的是動物趨近-規避沖突的結果，與焦慮程度直接相關[9]。抗焦慮藥可增加動物對開放臂的探索，使開臂滯留時間百分比上升。GABAA受體激動劑為臨床抗焦慮藥物的經典靶點之一，由此可以推斷，若右奧硝唑能夠激動GABAA受體，開放氯離子通道，則應該具有一定程度的抗焦慮作用。高架十字迷宮試驗結果表明，地西泮和高劑量右奧硝唑能顯著增加小鼠開臂滯留時間百分比，而左奧硝唑各劑量組均對小鼠高架十字迷宮各指標均無明顯影響。由于試驗設計所用各給藥劑量組均不影響小鼠開放臂和封閉臂總的進入次數，因此，該結果可以在一定程度上說明高劑量右奧硝唑可以產生抗焦慮作用，其機制可能與GABAA受體有關。

綜上所述，右奧硝唑能開放原代培養小鼠皮層神經元氯離子通道，增加GABAA受體α1亞基的表達，并在小鼠高架十字迷宮試驗中表現出抗焦慮活性；而左奧硝唑對氯離子通道、α1亞基及小鼠高架十字迷宮表現則無明顯影響；推測奧硝唑對映體對中樞神經系統的作用存在差異可能與其對GABAA受體的作用存在差異有關。

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Inhibition Effects and Mechanism of Ornidazole Enantiomers on Central Nervous System in Mice*

WEI Ting-ting1,SUN Ji-hong1,HAN Lu-wei2,WANG Zhi-qiang2,JI Hui1**
1Department of Pharmacology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009;2Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co Ltd,Nanjing 210038

Objective:The aim of the study was to investigate the central inhibition effect and mechanism of R-ornidazole through the γ-aminobutyric acid(GABA)ergic systems.Methods:The chloride influx was estimated in primary cultured prefrontal cortical neurons with treatments of R/S-ornidazole or GABA. After treatments of R/S-ornidazole ordiazepam,the GABAAreceptor α1subunits expression in primary cultured prefrontal cortical neurons was determined.The anxiolytic effect of R-ornidazole was measured with elevated plus maze test(EPM)in mice.Results:Compared with S-ornidazole,both R-ornidazole and GABA increased chloride influx and R-ornidazole significantly increased GABAAreceptor α1subunits expression.In addition,R-ornidazole showed anxiolytic effect in mice in the elevated plus maze test.Conclusion:The inhibition mechanism of R-ornidazole on central nervous system in mice may be through the modification of GABA ergic systems.

R/S-ornidazole;Cl-channel;GABA ergic systems

R965

A

1673-7806（2015）01-009-04

國家重大新藥創制科技重大專項資助項目（No．2008ZX09101-101）

魏婷婷，女，碩士生，研究方向：神經藥理學E-mail:sunnytingtingwei@126.com

**通訊作者季暉，女，教授，博士生導師，研究方向：生化藥理與老年病藥理 E-mail:huijicpu@163.com

2014-08-03

2014-10-08