冬蟲夏草、蟲草菌絲體及蛹蟲草中核苷類成分的測定

梅雪艷，李媛媛，沈于蘭江蘇省無錫藥品檢驗所，無錫 408；江南大學，無錫 4

冬蟲夏草、蟲草菌絲體及蛹蟲草中核苷類成分的測定

梅雪艷1，李媛媛2，沈于蘭1
1江蘇省無錫藥品檢驗所，無錫 214028；2江南大學，無錫 214122

目的：建立高效液相色譜法定量測定冬蟲夏草、蟲草菌絲體及蛹蟲草中的腺嘌呤、腺苷、蟲草素的含量，為冬蟲夏草及其代用品的質量研究及開發利用提供科學依據。方法：采用資生堂MG Ⅱ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-水梯度洗脫，檢測波長為260 nm，流速1.0 mL·min-1，外標法定量測定。結果：腺嘌呤、腺苷、蟲草素分別在0.001239～0.3098 mg· mL-1、0.001241～0.3102 mg·mL-1、0.000813～0.2032 mg·mL-1范圍內與峰面積呈良好的線性關系（r=0.9999）；平均回收率（n=3）分別為97.9%、97.0%、95.8%。結論：本法簡便準確，靈敏度高，通用性好，適用于冬蟲夏草及其代用品中腺嘌呤、腺苷、蟲草素的定量測定。

冬蟲夏草；腺嘌呤；腺苷；蟲草素；高效液相色譜法

冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體[1]，具有補益功效，有免疫調節、抗腫瘤、降血糖、抗氧化等多種藥理作用[2]。冬蟲夏草主要主產于我國青藏高原海拔3000～5000 m的高寒地帶，生長條件苛刻，導致資源有限。故市場上出現眾多冬蟲夏草替代品，其可分為兩種：一種是利用從冬蟲夏草中分離的不同菌種經深層發酵培養而成的蟲草菌絲體[3]；一種為半人工培養，將蟲草菌接種于蠶蛹等蟲體后，在適宜的環境條件下，使其長出同野生冬蟲夏草形態近似的子實體[4]。核苷類成分為冬蟲夏草及其代用品中的主要成分，有抗腫瘤、調節機體免疫力等藥理活性。

文獻報道，測定冬蟲夏草中核苷類成分的方法主要有高效液相色譜法[4]、毛細管電泳法[5]和液質聯用法[6]，現有文獻中多只選擇核苷類成分中腺苷和蟲草素為質控指標進行評估。本文建立了HPLC法測定冬蟲夏草及其替代品中核苷類成分的含量，采用簡單的梯度洗脫系統同時分離并定量測定腺苷、腺嘌呤，蟲草素三個成分（腺嘌呤為核苷類成分的重要組成，且其在冬蟲夏草及其替代品中含量差異較大，可作為區分依據，故本文增加了測定腺嘌呤這一成分）。該方法通用性好，簡便準確，分離時間快于文獻報道的方法。同時選擇了天然冬蟲夏草、蟲草菌絲體及蛹蟲草作為檢測對象，并對檢測結果進行了系統的分析，可為冬蟲夏草及其代用品的質量研究及開發利用提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器

梅特勒電子天平AG-285、XP-6電子天平；Agilent 1200高效液相色譜儀系統。

1.2 試藥

腺苷、腺嘌呤、蟲草素對照品購自中國食品藥品檢定研究院，批號 110879-200202、110886-201102、110858-200202；冬蟲夏草購自中國食品藥品檢定研究院（批號121201-201103）；蟲草菌絲體膠囊（均為藥品，廠家A批號：LF12004，廠家B批號：121147，廠家C批號：121146）；蛹蟲草由江蘇省蠶桑研究所提供。

乙腈為色譜醇，其它試劑為分析純；水為二次純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為資生堂MGⅡ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-水為流動相、梯度洗脫（洗脫程序見表1）；檢測波長：260 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL；柱溫：35℃。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取腺苷、腺嘌呤、蟲草素對照品各5 mg于10 mL量瓶中，加20%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品粉末 （過2號篩）0.5 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加20%甲醇約8 mL，超聲處理30 min，加20%甲醇至刻度，搖勻，濾過，為續濾液，即得。

2.3 專屬性實驗

在“2.1”項色譜條件下，腺嘌呤、腺苷、蟲草素峰形良好，保留時間分別為16.9、24.6、25.8 min（見圖1），分離度均大于1.5，樣品中雜質不干擾樣品測定。

圖1 （A）腺苷、腺嘌呤、蟲草素對照品溶液色譜圖；（B）冬蟲夏草正品供試品溶液色譜圖；（C）蛹蟲草供試品溶液色譜圖；（D）人工蟲草菌絲體供試品溶液色譜圖

2.4 標準曲線及線性范圍

精密量取腺苷、腺嘌呤、蟲草素對照品儲備液，用20%甲醇經適當比例稀釋，分別配成310.2、155.1、31.02、6.204、1.241 μg·mL-1（腺苷）；309.8、154.9、30.98、6.196、1.239 μg·mL-1（腺嘌呤）；203.2、 101.6、20.32、4.064、0.8130 μg·mL-1（蟲草素）的對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件進行測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，分別得回歸方程為：A＝32678.32C+11.90，r＝0.9999（腺苷）；A＝56730.43C+13.47，r＝0.9999（腺嘌呤）；A＝34496.00C-9.42，r＝0.9999（蟲草素）。腺苷、腺嘌呤、蟲草素在上述濃度范圍內線性關系均良好。

2.5 精密度實驗

精密吸取腺苷、腺嘌呤、蟲草素對照品混合溶液，按照“2.1”項下色譜條件連續進樣5次，測定峰面積，結果腺苷RSD為0.3%，腺嘌呤RSD為0.9%，蟲草素RSD為0.4%。

2.6 重復性實驗

取同一份的樣品5份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定，腺苷的含量RSD為1.3%；腺嘌呤的含量RSD為1.3%；蟲草素的含量RSD為0.9%。

2.7 穩定性實驗

取供試品溶液，室溫放置，分別在0、2、4、6、8 h進樣，依法測定，記錄峰面積，結果5次進樣測定腺苷峰面積RSD為0.4%，腺嘌呤峰面積RSD為0.6%，蟲草素峰面積RSD為0.8%，結果表明，供試品溶液在8 h內穩定。

2.8 加樣回收率實驗

取同一批蛹蟲草樣品（腺嘌呤含量0.093 mg·g-1，腺苷1.126 mg·g-1，蟲草素1.754 mg·g-1）9份，每份0.25 g，精密稱定，3份為一組，分別精密加入腺嘌呤濃度為0.02519 mg·mL-1，腺苷濃度為0.3002 mg· mL-1，蟲草素濃度為0.4521 mg·mL-1的混合對照品溶液0.5、1、2 mL。按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。腺嘌呤的平均加樣回收率為97.68%；腺苷平均加樣回收率為96.95%；蟲草素的平均加樣回收率為95.76%。

2.9 樣品測定

取冬蟲夏草及其代用品各2份，分別按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按照“2.1”項下色譜條件測定色譜峰面積，以外標法計算腺嘌呤、腺苷、蟲草素的含量，結果見表2。

3 討 論

3.1 實驗中選擇甲醇－水、乙腈－水進行等度、梯度洗脫，結果表明當使用乙腈－水系統進行梯度洗脫時，腺嘌呤、腺苷、蟲草素峰型良好，三個主峰以及供試品中主峰與雜質峰能得到基線分離，故選用乙腈-水系統進行梯度洗脫。梯度程序0～10 min使用100%水洗脫供試品中極性較大的雜質干擾，10.1～19 min使用3%的乙腈洗脫腺嘌呤成分，19.1～29 min使用8%的乙腈洗脫腺苷及蟲草素。

表2 腺嘌呤、腺苷、蟲草素的含量測定

3.2 從表2看出，冬蟲夏草、蟲草菌絲體和蛹蟲草中，腺嘌呤的含量依次為蟲草菌絲體、冬蟲夏草、蛹蟲草；腺苷的含量依次為蟲草菌絲體、蛹蟲草、冬蟲夏草；而蟲草素只在蛹蟲草中被測出，冬蟲夏草和蟲草菌絲體中均未測得，與文獻報道情況相符[4，6]。可見冬蟲夏草和蛹蟲草、蟲草人工菌絲體在核苷類成分構成比例上存在差異，而蟲草素為蛹蟲草中較特有的成分。

蟲草菌絲體膠囊（廠家A）為麥角菌科真菌蟲草頭孢（Cephalospovium sinens is Chen.sp.nov）經液體深層發酵所得菌絲體的干燥粉末制成的膠囊；蟲草菌絲體膠囊（廠家B）為發酵冬蟲夏草菌粉[Cs-CQ80中華被毛孢 Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu-et Zeng（1989）經液體深層發酵所得菌絲體的干燥粉末]制成的膠囊；蟲草菌絲體膠囊（廠家C）為發酵蟲草菌粉（Cs-4）的干燥粉末制成的膠囊。三種蟲草菌絲體的來源菌株不同，因此所含腺嘌呤和腺苷的百分含量及比例也不相同。但廠家根據其不同蟲草菌絲體膠囊中核苷類成分量的不同，制定了不同的裝量。從表2看出，當折算到每粒含量時，廠家A、B、C的腺嘌呤、腺苷含量基本持平。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 （一部）[S].北京：北京化學工業出版社，2010：106.

[2] 梁宗琦.中國真菌志，第32卷蟲草屬[M].北京：科技出版社，2007.

[3] 王尊生，俞永信，袁勤生.蟲草屬真菌的生物活性成分[J].中草藥，2004，35（10）：附8-11.

[4] 代君君，范 濤，吳傳華，等.人工栽培蛹蟲草研究的概述[J].安徽農業科學，2007，35（18）：5469-71.

[5] Li SP,Li P,Ji H,et al.The contents and their change of nucleosides from natrual cordyceps sinensis and cultured cordyceps mycelia[J].Acta Pharm Sin, 2001,36(6):436-9.

[6] 楊 釗，遲少云，張春輝，等.冬蟲夏草及其代用品中腺苷和蟲草素的LC-MS-MS定量分析研究 [J].中國中藥雜志，2007，32（19）：2018-20.

SimultaneousDetermination ofAdenine Adenosine and Cordycepin in Cordyceps sinensis and Its Substitutes

MEI Xue-yan1,LI Yuan-yuan2,SHEN Yu-lan1
1Wuxi Institute for Drug Control of Jiangsu Province,Wuxi 214028；2Jiangnan University,Wuxi 214122

Objective:To establish an HPLC method for simultaneous determination of adenine,adenosine and cordycepin in Cordyceps sinensis and similar products.Methods:A SHISEIDO MGⅡ C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)was used as the analytical column and the mobile phase was acetonitrile-water for gradient elution at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The UV detection wavelength was set at 260 nm.Results:Linear calibration curves were obtained in the concentration ranges of 0.001239～0.3098 mg·mL-1(adenine), 0.001241～0.3102 mg·mL-1(adenosine)and 0.000813～0.2032 mg·mL-1(cordycepin)(r=0.9999);The average recoveries (n=3)of adenine,adenosine and cordycepin were 97.9%,97.0%and 95.8%.Conclusion:The method is simple,rapid and reliable for the determination of adenine,adenosine and cordycepin in Cordyceps sinensis and similar products.

Cordyceps sinensi;Adenine;Adenosine;Cordycepin;HPLC

R927.2

A

1673-7806（2015）01-027-03

梅雪艷，女，高級工程師，主要從事藥品監管及藥物分析研究 E-mail:mxy6036@163.com

2014-06-26

2014-08-14