HPLC法與EMIT法測定人血中甲氨蝶呤血藥濃度差異分析*

唐 茜，孫魯寧，沈 燕，張宏文，陸 超，龔曉健，王永慶**

1中國藥科大學藥理教研室，南京 210009；南京醫科大學第一附屬醫院2臨床藥理研究室，3兒科，南京210029

HPLC法與EMIT法測定人血中甲氨蝶呤血藥濃度差異分析*

唐 茜1，2，孫魯寧2，沈 燕3，張宏文2，陸 超3，龔曉健1**，王永慶2**

1中國藥科大學藥理教研室，南京 210009；南京醫科大學第一附屬醫院2臨床藥理研究室，3兒科，南京210029

目的：比較酶增強免疫分析法（EMIT）和高效液相色譜法（HPLC）測定甲氨蝶呤（MTX）血藥濃度結果，并分析兩種測定方法所得結果存在偏差的原因。方法：7例骨肉瘤患者，采用大劑量（10 g·m-2）甲氨蝶呤靜脈滴注后，同時采用EMIT法和HPLC法測定血漿中MTX藥物濃度，并對結果進行比較。結果：骨肉瘤患者給藥后48、60、96 h的血藥濃度，采用EMIT法測得的值約是HPLC法測得值的1.72倍；采用EMIT法測得的血藥濃度遠遠低于HPLC法測得的MTX及其代謝物7-羥基甲氨喋呤 （7-OHMTX）的濃度之和。結論：MTX的主要代謝物7-OHMTX與EMIT法檢測MTX存在顯著的交叉反應，這可能造成EMIT法測定結果高于HPLC法。

酶增強免疫法；高效液相色譜法；甲氨蝶呤；7-羥基甲氨喋呤血藥濃度

甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）為葉酸類抗腫瘤藥，通過競爭性抑制二氫葉酸還原酶，阻止二氫葉酸還原為四氫葉酸，推遲和阻礙DNA和RNA的合成而發揮抗腫瘤作用[1]。MTX在體內代謝的個體差異較大，其療效、毒性均與使用劑量相關，因此HDMTX-CF化療風險很大，必須通過監測MTX血藥濃度，及時調整MTX使用劑量和亞葉酸鈣的解救劑量，在確保療效的同時防止嚴重毒副反應的發生[2]。

目前測定甲氨蝶呤血藥濃度的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）和酶增強免疫法（EMIT）、液質聯用法等[3-4]。HPLC法專一性強，可將藥物與代謝產物分離，是檢測MTX血藥濃度常用方法[4-5]。酶免疫增強法（EMIT）是一種均相酶免疫分析技術，檢測是基于樣本中的藥物與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 （G-6-PDH）標記的半抗原競爭抗體結合位點，與抗體結合后，酶的活性降低，可以根據酶的活性來確定樣本中待測物的濃度[6]；該法專屬性不強，不能區分MTX及其活性代謝物的各自濃度，而且需要使用儀器配套試劑盒，價格較昂貴，且線性范圍較窄，如遇到高濃度樣本時需要稀釋重新檢測，從而增加檢測成本及實驗時間[7]。本文通過2種方法測定同一份樣本，比較各自的濃度差異，從而為臨床合理用藥提供參考。

1 材 料

1.1 儀器和試劑

Agilent Technologies 1290 Infinity高效液相色譜儀；VIVA全自動免疫分析儀（美國德靈公司）。

甲氨蝶呤（純度：99.4%，批號：100138-201104，中國食品藥品檢定研究院）；7-羥基甲氨蝶呤 （純度：98%，批號：11-THT-2-1，Toronto Research Chemicals Inc.）；替硝唑 （純度：99.9%，批號：100336-200703，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（批號：707172，Merck公司）、乙腈 （批號：711922，Merck公司）、甲酸（批號：E1404004，Aladdin indus-trial corporation）均為色譜純。

1.2 樣本的收集

收集2013年9月至2014年9月南京醫科大學第一附屬醫院兒科使用大劑量（10 g·m-2）甲氨蝶呤的7例骨肉瘤患者的血樣，時間點為給藥后48、60、96 h。

2 方 法

2.1 HPLC法

2.1.1 色譜條件 ZORABX Eclipse Plus C18分析柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：0.25%甲酸-乙腈（95∶5，v/v）；柱溫：35℃；流速：1 mL·min-1；檢測波長：305 nm。

2.1.2 樣本處理步驟 （1）將肝素抗凝的全血樣本于8000 r·min-1離心8 min，取上清液300 μL。（2）加入內標液替硝唑30 μL（50 ng·mL-1），渦旋混勻。（3）加入甲醇150 μL，乙腈1 mL，于2000 r·min-1渦旋10 min，16000 r·min-1離心15 min。（4）取上清液，置于離心濃縮儀，45℃，3.5 h，吹干。（5）在吹干后的各試管中加入 0.1%甲酸溶液200 μL，渦旋5 min，16000r·min-1離心15min。（6）取上清液，進樣20μL。

2.1.3 標準曲線的建立 精密吸取MTX及7-OHMTX混合標準儲備液（100 μg·mL-1）適量，分別加入空白血漿，使甲氨蝶呤及7-OHMTX濃度為0.03、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg·mL-1的模擬血漿樣品，按“2.1.2樣本處理步驟”操作，以MTX或7-OHMTX的血藥濃度為C，MTX或7-OHMTX與內標替硝唑的峰面積比值為f作回歸分析，得標準曲線方程。MTX的線性方程為：f1=0.006+0.304C（r= 0.9940）；7-OHMTX的線性方程為：f2=0.000+0.256C（r=0.9930）。本法兩者的最低檢測限均為0.03 μg· mL-1。

2.1.4 精密度及準確度測定 分別取高、中、低3種濃度的MTX及7-OHMTX的質控品，分別于同日和不同日測定日內、日間RSD并考察其準確度（見表1）。

表1 HPLC法測定MTX和7-OHMTX的準確度和精密度

2.1.5 穩定性試驗 取高、中、低3種濃度的質控樣本，分別考察其室溫、放置24 h的穩定性，-80℃冷凍保存7天的穩定性，反復凍融2次的穩定性，結果無明顯變化，相對標準差（RSD）＜15%。

2.2 EMIT法

使用德靈公司的VIVA全自動免疫分析儀，按照儀器標準操作規范，每批次樣本測定時隨行質控品平行測定。結果見表2。

2.3 數據統計分析

研究結果表明，骨肉瘤患者開始給藥后48、60、96 h使用EMIT法測得的血藥濃度約是HPLC法測得MTX值的1.72倍；EMIT法測得的血藥濃度遠遠低于HPLC法測得的MTX及其代謝物7-OHMTX濃度之和。HPLC法測得的7-OHMTX血藥濃度通常是MTX濃度的十幾倍甚至更高。見表3。

表2 EMIT法測定MTX的準確度和精密度

表3 骨肉瘤患者給予MTX 48、60、96 h后血藥濃度兩種方法測定結果比較（n=5）

3 討 論

VIVA全自動免疫分析儀帶有自動取樣系統和良好控溫系統及數據處理與貯存器，具有自動化程度高、樣本用量少、樣本不需要預處理的優點，適用于急診和大樣本的分析測定。HPLC法可將藥物和體內代謝物良好分離，儀器精密度好，但操作時程長，特別是血漿樣品前處理較繁瑣。但由于EMIT法是利用抗原、抗體相互識別并結合來產生檢測信號，當某些抗原具有與待測藥物相同的抗原表面標志或者抗體有著多個抗原結合位點時，可導致抗體與那些化學結構相近于母體的代謝產物及樣本中的內源性物質產生交叉反應，其結果會出現偏差。從測定的結果分析，采用EMIT法測定的MTX血藥濃度明顯高于采用HPLC-UV法。MTX在細胞外主要代謝成7-OHMTX和一些4-氨基-4-脫氧-N10-甲基喋酸（DAMPA），盡管這些代謝物與二氫葉酸還原酶的親和力更低，但因為它們與MTX的相似結構，在EMIT法測定時會干擾MTX的濃度測定[8-9]。在肝臟中大量的MTX被乙醛氧化酶氧化，產生7-OHMTX。7-OHMTX的血藥濃度可能會超過MTX，尤其在使用大劑量MTX的患者體內，在給藥后10～12 h 7-OHMTX成為最主要的代謝物。該代謝物與MTX相比對二氫葉酸還原酶的親和力更低，但它的多聚谷氨酸鹽衍生物抑制胸苷酸合酶和二氫葉酸還原酶的效能，卻與MTX多聚谷氨酸不相上下。7-OHMTX因其緩慢的消除率能夠減弱MTX的療效，同時在細胞水平，通過與MTX競爭細胞攝取和細胞內的多聚谷氨酸化，甚至可引起對MTX的抵抗[10-11]。而且 EMIT測出的濃度主要也是 MTX和 7-OHMTX的濃度之和，這很可能就是EMIT法測得的MTX血藥濃度高于HPLC法測得值的原因。

[1] 任秀華，杜 光，劉 東.液相色譜-串聯質譜法測定人血漿中甲氨蝶呤的血藥濃度及其臨床應用[J].中國醫院藥學雜志，2014，34（10）：801-4.

[2] 蔡 訊，林 峰，趙 暉，等.骨肉瘤化療中甲氨蝶呤血藥濃度測定及影響因素分析[J].中國癌癥雜志，2007，17（10）：762-5.

[3] 李惠芬，許 俐.高效液相色譜法測定甲氨蝶呤血藥濃度[J].天津醫藥，2003，31（7）：446-7.

[4] 張媛媛，徐康康.三種檢測方法測定甲氨蝶呤血藥濃度的比較分析[J].安徽醫藥，2014，18（2）：357-60.

[5] 余 勤，梁茂植，向 瑾，等.EMIT法和HPLC法監測苯妥英和苯巴比妥血藥濃度比較研究 [J].檢驗醫學，2007，22（4）：455-8.

[6] 黃成瓊，馬傳學，朱清華.EMIT法和HPLC法監測環孢菌素A血藥濃度比較研究 [J].藥學與臨床研究，2009，17（2）：104-6.

[7] 黃文鶯，王長連，劉亦偉，等.EMIT法與HPLC法測定人血中丙戊酸濃度的比較 [J].中國當代醫藥，2011，18（27）：5-7.

[8] Pignon T,Lacarelle B,Duffaud F,et al.Pharmacoki-netics of high-dose methotrexate in adult osteogenic sarcoma[J].Cancer Chemother Pharmacol,1994,33(5): 420-4.

[9] 宋曉勇，張永州，吳先闖，等.EMIT法與HPLC法測定人血漿中環孢素A濃度的比較研究 [J].中國藥房, 2011，22（26）：2443-4.

[10] Sholar PW,Baram J,Seither R,et al.Inhibition of folate-dependent enzymes by 7-OH-methotrexate[J]. Biochem Pharmacol,1988,37(18):3531-4.

[11] Fotoohi K,Jansen G,Assaraf YG,et al.Disparate mechanisms of antifolate resistance provoked by methotrexate and its metabolite 7-hydroxymethotrexate in leukemia cells: implications for efficacy of methotrexate therapy[J].Blood,2004,104(13):4194-201.

Comparison of EMIT and HPLC Method in Monitoring Methotrexate in Osteosarcoma Patients Blood*

TANG Qian1,2,SUN Lu-ning2,SHEN Yan3,ZHANG Hong-wen2,LU Chao3, GONG Xiao-jian1**,WANG Yong-qing2**
1China Pharmaceutical University,Nanjing 210009;2Research Division of Clinical Pharmacology,3Department of Pediatrics,the First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University,Nanjing 210029

Objective:To compare the results of plasma methotrexate (MTX)concentrations determined by enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT)and high performance liquid chromatography(HPLC) method in osteosarcoma patients.Methods:Seven patients received large-dose(10 g·m-2)MTX through in-travenous infusion.Plasma MTX levels were evaluated by EMIT and HPLC for comparison.Results:Plas-ma MTX concentrations determined by EMIT after the administration for 48,60 and 96 h were about 1.72 times of those by HPLC method.MTX levels determined by EMIT were lower than the total concentrations of MTX and 7-Hydroxymethotrexate (7-OHMTX)determined by HPLC.Conclusion:7-OHMTX,which is the major plasma metabolite of MTX,has cross-reactivity with MTX when determined by EMIT,and may influence the concentration results of MTX measured by EMIT.

Enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT);High performance liquid chromatogra-phy(HPLC);7-Hydroxymethotrexate methotrexate;Plasma concentration

R969.1

A

1673-7806（2015）02-141-03

江蘇省醫療器械重點項目（BM2011017）；江蘇省衛生廳醫學重點人才項目（RC201170，H201108）

唐茜，女，碩士 E-mail:452022435@qq.com

* *通訊作者龔曉健，男，副教授 E-mail:gongxj99@163.com王永慶，男，主任藥師 E-mail:wyqjsph@163.com

2014-10-24

2014-12-11