注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉含量測定方法的研究

董 靜，聶穎杰，李三紅*南京市口腔醫院（南京大學醫學院附屬口腔醫院），南京 0008；南京優科生物醫藥有限公司，南京0000

注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉含量測定方法的研究

董 靜1，聶穎杰2，李三紅1*
1南京市口腔醫院（南京大學醫學院附屬口腔醫院），南京 210008；2南京優科生物醫藥有限公司，南京210000

目的：建立同時測定注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉中頭孢曲松和他唑巴坦含量的方法。方法：色譜柱為DIKMA Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為0.03 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液-10%四丁基氫化銨溶液（995∶5），用磷酸調pH至3.0，流動相B為乙腈-甲醇（1∶2），以A∶B=70∶30作為流動相；波長為230 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃。結果：頭孢曲松和他唑巴坦之間的分離度為2.89，頭孢曲松和反式頭孢曲松的分離度為12.41；經酸、堿、氧化、高溫和光照破壞試驗表明，頭孢曲松和他唑巴坦與其它雜質的分離度良好。頭孢曲松和他唑巴坦在線性范圍內進樣量和峰面積呈良好的線性關系，相關系數分別為1和0.9999；平均加樣回收率分別為100.3%和99.5%，RSD分別為0.90%和0.66%。結論：該方法操作簡便，專屬性和耐用性好，結果準確，可同時測定注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉中頭孢曲松和他唑巴坦的含量。

高效液相色譜法；頭孢曲松；他唑巴坦；含量測定

注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉是頭孢曲松和他唑巴坦按3∶1（w/w）組成的復方制劑。頭孢曲松鈉為第三代頭孢菌素類抗生素，能夠抑制細菌細胞壁合成而起到殺菌作用，但易被β-內酰胺酶水解而失去活性；他唑巴坦鈉對β-內酰胺酶有抑制作用，兩者聯用發揮協同抗菌作用，適用于對頭孢曲松耐藥、對本復方敏感的β-內酰胺酶細菌引起的中重度感染。根據Mohnarin年度報告：我國臨床分離菌耐藥性較為嚴重，特別是超廣譜β-內酰胺酶（extended spectrum beta-lactamases，ESBLs）的腸桿菌科細菌，在臨床上十分普遍。

注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉可有效克服因ESBLs引起的耐藥，并能阻斷或延緩耐藥的繼續發展，是一個安全、有效，臨床運用廣泛的復方抗生素[1]。原標準采用反相高效液相色譜法測定了兩者的含量，但未對反式頭孢曲松進行有效的分離，影響了含量測定的準確性。

本文重新建立反相高效液相色譜法同時測定頭孢曲松和他唑巴坦含量的方法，對酸、堿、氧化和高溫破壞后的雜質和兩個主峰的分離情況進行了研究，規定了頭孢曲松和反式頭孢曲松的分離度，提高了含量測定的準確性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-1260高效液相色譜系統 （含1260 Quat PumpVL泵，1260ALS自動進樣器，1260TCC控溫箱，1260VWD紫外檢測器和OpenLAB色譜工作站，安捷倫）；AL204型電子分析天平（德國梅特勒儀器公司）；BP211D型電子分析天平 （德國賽多利斯儀器公司）；320-SpH計〔梅特利－托利多儀器（上海）有限公司〕。

1.2 試藥

頭孢曲松對照品（純度83.7%，中國藥品生物制品檢定所，批號：130480-200903）；他唑巴坦對照品（純度99.1%，中國藥品生物制品檢定所，批號：130511-200402）；反式頭孢曲松對照品 （純度：99.4%，僅供HPLC系統適用性實驗用，中國藥品生物制品檢定所，批號：130660-201001）；注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉粉針劑（3∶1）（南京優科制藥有限公司，批號：20120401、20120402、20120403）。

磷酸二氫鉀和10%四丁基氫化銨為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，購自Merck公司；其余試劑為分析純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[2-6]

色譜柱為DIKMA-C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為0.03 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液-10%四丁基氫化銨溶液（995∶5）的混合液（4.08 g磷酸二氫鉀加5 mL 10%四丁基氫氧化銨溶液，加水稀釋至1000 mL，用磷酸調節pH為3.0），流動相B為甲醇-乙腈=2∶1（v/v）的混合溶液，以A∶B=70∶30（v/ v）；柱溫為30℃；波長為230 nm；流速為1.0 mL· min-1；進樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白對照溶液 以流動相做為空白對照溶液。

2.2.2 系統適用性溶液 取頭孢曲松對照品、反式頭孢曲松對照品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含頭孢曲松1.5 mg、反式頭孢曲松15 μg的溶液，作為系統適用性溶液。

2.2.3 對照品溶液 取頭孢曲松、他唑巴坦對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL分別含頭孢曲松1.5 mg、他唑巴坦0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.4 供試品溶液 精密稱取100 mg（相當于頭孢曲松75 mg，他唑巴坦25 mg），置50 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.3 系統適用性

精密量取空白對照溶液、系統適用性溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。系統適用性溶液色譜圖中頭孢曲松和他唑巴坦的理論塔板數分別為5556和8136；分離度分別為14.51和2.89；色譜圖中頭孢曲松和反式頭孢曲松的分離度為12.41；空白對照對檢測沒有影響。色譜圖見圖1。

2.4 專屬性試驗

取注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉適量，分別進行酸、堿、高溫、氧化和光破壞后，照供試品溶液制備方法制備樣品溶液?？疾煸诂F有分析條件下降解產物和頭孢曲松與他唑巴坦主峰的分離度。結果：本品經堿、氧化、高溫、光照破壞后降解產物有明顯增加，酸破壞后降解產物沒有明顯增加，降解產物與頭孢曲松、他唑巴坦能完全分離。見圖2。

2.5 線性范圍

取頭孢曲松對照品和他唑巴坦對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成約含頭孢曲松1.5 mg·mL-1、他唑巴坦0.5 mg·mL-1的溶液，作為線性對照品溶液。分別取溶液2、5、8、10、12、15 μL依次注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸。頭孢曲松回歸方程：Y=2765.3X+66.19，r=1，線性范圍為3.0～22.5 μg；他唑巴坦回歸方程：Y=342.78X+ 16.031，r=0.9999，線性范圍為1.0～7.5 μg。

2.6 進樣精密度試驗

取線性試驗項下的對照品溶液，精密量取10 μL依次注入液相色譜儀，連續進樣6次，記錄峰面積，頭孢曲松和他唑巴坦峰面積的RSD分別為0.82%和0.51%。試驗結果表明，本法進樣精密度良好。

2.7 定量限考察

取頭孢曲松對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成約含頭孢曲松1.5 mg·mL-1的溶液，逐級稀釋，進行測定，按信噪比10∶1，確定頭孢曲松的最小定量限為0.15 ng。

取他唑巴坦對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成約含他唑巴坦0.5 mg·mL-1的溶液，逐級稀釋，進行測定，按信噪比10∶1，確定他唑巴坦的最小定量限為1.00 ng。

2.8 重復性試驗

取本品（批號：20120401）適量，精密稱定，加流動相溶解并制成每毫升含頭孢曲松1.5 mg、含他唑巴坦0.5 mg的溶液，作為供試品溶液，共配制6份，進樣測定。結果按無水物計，頭孢曲松和他唑巴坦的含量分別為710 μg·mg-1和233 μg·mg-1，RSD分別為0.97%和1.52%。

2.9 穩定性試驗

取本品（批號：20120401），加流動相制成每毫升含頭孢曲松1.5 mg、含他唑巴坦0.5 mg的溶液，作為供試品溶液，置于溫度為5℃自動進樣器，分別于0、1、2、4、6、8、10、12 h進樣測定。頭孢曲松和他唑巴坦峰面積RSD分別為0.65%和0.59%，表明供試品溶液在5℃條件下12 h內相對穩定。

2.10 加樣回收率試驗

按照供試品溶液80%、100%、120%的濃度配制高、中、低三個樣品溶液，每個溶液配制3份，進樣測定，計算回收率。結果見表1。頭孢曲松和他唑巴坦的平均回收率分別為100.3%和99.5%，RSD（n= 9）分別為0.90%和0.66%。

2.11 耐用性考察

分別考察了鹽用量、柱溫、流速、pH值、四丁基氫氧化銨用量、流動相比例和波長在±5%范圍內變化及采用不同的色譜柱對本品的含量測定的影響。上述不同條件下，頭孢曲松和他唑巴坦的平均含量分別為101.7%和99.6%，RSD（n=3）分別為0.17%和0.17%。表明本法耐用性良好，微調鹽用量、柱溫、流速、pH值、四丁基氫氧化銨用量、流動相比例和波長及更換不同廠家的色譜柱，均對本品含量測定結果無影響。

2.12 注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉（3∶1）含量測定

取注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉（3∶1）三批（批號：20120401、20120402、20120403），按“2.1”項下色譜條件分別測定頭孢曲松和他唑巴坦含量，見表2。

表1 回收率試驗結果

表2 含量測定結果（n=6）

3 討 論

參考《中國藥典》他唑巴坦質量標準、《美國藥典》標準[2-3]，對測定方法進行了篩選，分別試用了中國藥典方法和美國藥典的方法，根據系統適用性結果，最終以中國藥典方法為基礎建立了上述含量測定的方法。中國藥典方法和調整后的方法結果對比見表3。

在選擇檢測波長時，因為要同時測定頭孢曲松和他唑巴坦的含量，檢測波長需要滿足兩個成分均有吸收的條件。我們分別取頭孢曲松對照品、他唑巴坦對照品適量，加流動相配制成10 μg·mL-1的溶液，照紫外分光光度法，在190～400 nm波長范圍進行紫外掃描，頭孢曲松的最大吸收波長為245 nm，由于他唑巴坦在245 nm處無吸收，且兩組分的配比為3∶1，故選擇他唑巴坦吸收較強的230 nm作為檢測波長。

本文建立的注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉含量測定的色譜條件，是基于頭孢曲松、他唑巴坦與主要雜質分離度試驗及破壞性試驗等方法學研究上得到的優化結果，其靈敏度高、專屬性強、操作簡便，能夠同時測定本品中頭孢曲松和他唑巴坦的含量。

表3 中國藥典方法和調整后的方法結果對比

[1] 肖永紅，沈 萍，魏澤慶，等.Mohnarin 2011年度全國細菌耐藥監測 [J].中華醫院感染學雜志，2012，22（22）：4946-52.

[2] 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄194-5.

[3] 美國藥典中文版第2卷 [S].北京：化學工業出版社，USP34-NF29：1924-5.

SimultaneousDetermination ofCeftriaxoneand Tazobactam Contentin Ceftriaxone Sodium and Tazobactam Sodium(3∶1)for Injection

DONG Jing1,NIE Ying-jie2,LI San-hong1*
1Nanjing Stomatological Hospital,Medical School of Nanjing University,Nanjing 210008;2Nanjing Yoko Pharmaceutical Co.Ltd,Nanjing 210000

Objective:To establish a new method for simultaneous determination of ceftriaxone and tazobactam contents in ceftriaxone sodium and tazobactam sodium (3∶1)for injection.Methods:A DIKMA Diamonsil C18column (4.6 mm×250 mm,5 μm)was used with the mobile phase consisted of mobile phase A∶mobile phase B (70∶30)at a flow rate of 1.0 mL·min-1,and the detection wavelength was set at 230 nm. The mobile phase A consisted of 0.03 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate and 10%tetrabutyl ammoni-um hydroxide(995∶5,pH 3.0),the mobile phase B consisted of acetonitrile and methanol(1∶2).The column temperature was 30℃.Results:Ceftriaxone and tazobactam were well-separated,and the separation degree between them was 2.89.The separation degree between ceftriaxone and trans-ceftriaxone was 12.41.Ceftri-axone and tazobactam were separated very well from their impurities under the condition of acid,alkali, oxidation,high temperature or light damage.Ceftriaxone and tazobactam showed good linear relationship be-tween sampled amount and peak area in the linear range of calibration curve,and the correlation coeffi-cients were 1 and 0.9999.The average recoveries were 100.3%and 99.5%,RSD were 0.90%and 0.66%. Conclusion:This method is simple,specific,accurate and can be used for simultaneous determination of ceftriaxone and tazobactam in the ceftriaxone sodium and tazobactam sodium(3∶1)for injection.

High performance liquid chromatography (HPLC);Ceftriaxone;Tazobactam;Content deter-mination

R927.2

A

1673-7806（2015）02-131-04

董靜，女，主管藥師 E-mail:tokyodj@yeah.net

*通訊作者李三紅，女，副主任中藥師 E-mail:lshaaaa@163.com

2014-10-20

2014-11-13