人卵丘細(xì)胞lncRNA ENST00000502521的表達(dá)與胚胎發(fā)育的關(guān)系

李 娟，曹云霞，劉婷婷，許孝鳳

人卵丘細(xì)胞lncRNA ENST00000502521的表達(dá)與胚胎發(fā)育的關(guān)系

李 娟，曹云霞，劉婷婷，許孝鳳

摘要目的 探討體外受精（IVF）周期人卵丘細(xì)胞（CCs）中l(wèi)ncRNA ENST00000502521的表達(dá)與卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育的關(guān)系，判斷其對體外受精-胚胎移植（IVF-ET）結(jié)局的預(yù)測價值。方法 收集40例首次接受長方案超促排卵患者的卵丘細(xì)胞，根據(jù)卵丘細(xì)胞圍繞的卵母細(xì)胞受精后胚胎發(fā)育情況將卵丘細(xì)胞分成兩組，優(yōu)質(zhì)胚胎組和低質(zhì)胚胎組，采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)檢測兩組卵丘細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ENST00000502521的相對表達(dá)量，分析其與胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局的關(guān)系；采用受試者工作特征曲線（ROC）評價lncRNA ENST00000502521相對表達(dá)量對臨床妊娠結(jié)局的預(yù)測價值。結(jié)果 IVF患者低質(zhì)胚胎組中l(wèi)ncRNA ENST0000050252表達(dá)較優(yōu)質(zhì)胚胎組明顯增高（P＜0.05），且未妊娠組lncRNA ENST00000502521相對表達(dá)量較妊娠組增高（P＜0.05）；lncRNA ENST00000502521預(yù)測妊娠結(jié)局的ROC曲線下面積（AUC）為0.71（P＜0.05，95%CI：0.55～0.87），靈敏度為84.2%，特異性為61.9%。結(jié)論lncRNA ENST00000502521可能參與影響卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育，可作為一個潛在的分子標(biāo)志物預(yù)測胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局。

關(guān)鍵詞卵丘細(xì)胞；長鏈非編碼RNA；ENST00000502521；胚胎發(fā)育

2015-03-16接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，合肥 230022

人卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞關(guān)系密切，通過對卵丘細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究可以找到預(yù)測卵母細(xì)胞質(zhì)量、胚胎發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局的分子標(biāo)志物［1-4］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA分子，參與了多種病理生理過程［5-6］。最近Yerushalmi et al［7］采用芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)人卵丘細(xì)胞中有大量lncRNA產(chǎn)生，其中有一些可能參與了卵母成熟、受精及胚胎發(fā)育。在該實驗前期的卵丘細(xì)胞芯片表達(dá)譜結(jié)果的基礎(chǔ)上，并結(jié)合生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)一個新的lncRNA ENST00000502521位于3號染色體q22.1上，但其是否是影響胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局的關(guān)鍵調(diào)控基因，目前還不清楚，因此需要進(jìn)一步驗證芯片表達(dá)譜的結(jié)果。該研究采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)檢測不同質(zhì)量卵母細(xì)胞來源的卵丘細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ENST00000502521的相對表達(dá)量，分析其與胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局的關(guān)系，為進(jìn)一步探討其在卵母細(xì)胞成熟、受精及胚胎發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 卵丘細(xì)胞來源 卵丘細(xì)胞來源于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心首次行長方案體外受精（in vitro fertilization，IVF）治療的40例不孕癥患者，年齡20～35（31.19±5.29）歲，不孕因素為女方輸卵管因素，男方因素引起的不孕不納入研究范圍。

1.1.2 主要試劑 Total RNA Isolation Kit I（美國Omega公司）；PrimeScriptRT reagent Kit和熒光定量PCR試劑盒SYBRPremix ExTaq II kit（日本TaKaRa公司）。

1.2 方法

1.2.1 卵巢刺激方案 患者均采用常規(guī)長方案控制性促排卵。自前一個月經(jīng)周期的黃體中期開始使用促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotrophin releasing hormone agonists，GnRH-a）（達(dá)菲林）降調(diào)節(jié)，月經(jīng)周期第3～5天開始使用重組促卵泡素（果納芬）150～300 IU／d，定期進(jìn)行陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育及血清雌二醇、孕酮、黃體生成素水平的測定，當(dāng)主導(dǎo)卵泡中有1個直徑達(dá)到18 mm或2個達(dá)17 mm或3個達(dá)16 mm時，于當(dāng)天停用促性腺激素，當(dāng)晚約10時予以人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）10 000 IU肌注，注射HCG后約36 h行取卵術(shù)。

1.2.2 卵丘細(xì)胞的收集 取卵后在卵母細(xì)胞-放射冠-卵丘復(fù)合物上劃取部分卵丘細(xì)胞團(tuán)，分別單獨放入一個微量離心管，-80℃冷凍保存。卵母細(xì)胞單獨受精培養(yǎng)，受精后第2天觀察胚胎卵裂情況，第3天行卵裂球期胚胎評分。

1.2.3 實驗分組 根據(jù)受精后第3天卵裂球數(shù)目、形態(tài)、胞質(zhì)顆粒和胞漿碎片等參數(shù)行胚胎形態(tài)學(xué)評分。細(xì)胞團(tuán)均勻?qū)ΨQ，細(xì)胞數(shù)≥7個，大小一致，碎片≤20%的胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎；細(xì)胞團(tuán)不對稱，細(xì)胞數(shù)＜7個，大小不一致，碎片＞20%的胚胎為形態(tài)學(xué)差質(zhì)量胚胎。優(yōu)質(zhì)胚胎組卵丘細(xì)胞來自于受精后評分為優(yōu)質(zhì)胚胎的卵母細(xì)胞，低質(zhì)胚胎組卵丘細(xì)胞來自于受精后為差質(zhì)量胚胎的卵母細(xì)胞。

1.2.4 臨床妊娠判定標(biāo)準(zhǔn) 胚胎移植后第14天測尿HCG或血HCG行生化妊娠初步診斷，于移植后第35天行超聲檢查，宮腔內(nèi)見孕囊或（和）胎心搏動者（包括宮外妊娠）診斷為臨床妊娠。

1.2.5 RNA提取和qRT-PCR 使用Total RNA Isolation Kit I提取細(xì)胞總RNA后將其濃度定為200～300 ng／μl，于-80℃保存?zhèn)溆?。根?jù)PrimeScriptRT reagent Kit和SYBRPremix ExTaq II kit說明書逆轉(zhuǎn)錄提取到的RNA后進(jìn)行RT-PCR，以GAPDH為內(nèi)參。lncRNA ENST00000502521上游引物：5′-GGCAGGTTTCTCTTGTTGTCT-3′，下游引物：5′-GGCAGGTTTCTCTTGTTGTCT-3′；GAPDH上游引物：5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，下游引物：5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。采集每個定量PCR反應(yīng)的閾循環(huán)值后，將定量PCR結(jié)果以2-ΔΔCt表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。采用單樣本K-S檢驗方法檢驗變量是否符合正態(tài)分布；組間正態(tài)分布資料比較采用兩獨立樣本t檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson法。采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）評價lncRNA ENST00000502521相對表達(dá)量對臨床妊娠結(jié)局的預(yù)測價值。

2　結(jié)果

2.1 IVF患者卵丘細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ENST00000 502521表達(dá) 采用qRT-PCR技術(shù)檢測兩組卵丘細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ENST00000502521的相對表達(dá)量。85%的患者（34／40）低質(zhì)胚胎組lncRNA ENST00000502521表達(dá)水平高于優(yōu)質(zhì)胚胎組（P＜ 0.05）；優(yōu)質(zhì)胚胎組lncRNA ENST00000502521的表達(dá)水平為（9.15±2.56），低質(zhì)胚胎組lncRNA ENST00000502521的表達(dá)量為（7.94±2.57）；低質(zhì)胚胎組的表達(dá)量較優(yōu)質(zhì)胚胎組平均增高了約（2.75 ±1.36）倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。lncRNA表達(dá)量采用ΔCt值表示，ΔCt值越大則代表lncRNA表達(dá)水平越低。見圖1。

2.2 IVF患者一般情況和lncRNA ENST00000 502521表達(dá)及妊娠結(jié)局的關(guān)系 采用相關(guān)性分析比較患者一般情況和卵丘細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ENST0000 0502521表達(dá)及妊娠結(jié)局的關(guān)系。結(jié)果顯示：卵丘細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ENST00000502521表達(dá)水平及妊娠結(jié)局與患者年齡、不孕年限、體質(zhì)指數(shù)、基礎(chǔ)性激素水平、促性腺激素（gonadotropin，Gn）用量、Gn天數(shù)等一般情況無明顯相關(guān)性。

2.3 IVF患者卵丘細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ENST000005 02521表達(dá)與妊娠結(jié)局的關(guān)系 按患者妊娠結(jié)局將40例患者分為妊娠組（n＝21）和未妊娠組（n＝19）。妊娠組lncRNA ENST00000502521表達(dá)量低質(zhì)胚胎組（8.02±2.40）較優(yōu)質(zhì)胚胎組（9.49± 2.64）平均增高了（2.23±1.07）倍；未妊娠組lncRNA ENST00000502521表達(dá)量低質(zhì)胚胎組（7.85 ±2.80）較優(yōu)質(zhì)胚胎組（8.77±2.49）平均增高了（3.21±1.44）倍；未妊娠組lncRNA ENST00000 502521相對表達(dá)量較妊娠組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.4 lncRNA ENST00000502521相對表達(dá)量對臨床妊娠結(jié)局的預(yù)測價值 采用ROC曲線評價lncRNA ENST00000502521相對表達(dá)量對臨床妊娠結(jié)

局的預(yù)測價值。曲線下面積（area under curve，AUC）代表lncRNA ENST00000502521相對表達(dá)量對妊娠結(jié)局的預(yù)測價值。以卵丘細(xì)胞lncRNA ENST00000502521相對表達(dá)量為檢驗變量，以臨床妊娠結(jié)局為狀態(tài)變量（臨床妊娠＝1），建立ROC曲線（P＜0.05，AUC＝0.71，95%CI：0.55～0.87），靈敏度為84.2%，特異性為61.9%。見圖3。

3　討論

胚胎發(fā)育與種植潛能評估一直是人類輔助生殖領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)，選擇最具發(fā)育潛能的胚胎移植并建立妊娠是人類輔助生殖技術(shù)的首要目標(biāo)。胚胎質(zhì)量的優(yōu)劣在很大程度上取決于所獲卵子的質(zhì)量［8］。有研究［9］表明胚胎質(zhì)量與卵母細(xì)胞質(zhì)量密切相關(guān)。人卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞關(guān)系密切，前者直接影響后者的發(fā)育、成熟及胚胎質(zhì)量［10-11］。通過對卵丘細(xì)胞基因表達(dá)的研究，或許能夠發(fā)現(xiàn)可能作為卵母細(xì)胞質(zhì)量、胚胎發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局的分子標(biāo)志物，并結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評分方法可以為胚胎選擇提供更加客觀、準(zhǔn)確且無創(chuàng)的方法。

本研究排除男方因素可能對卵母細(xì)胞受精的影響，首先比較了來自不同質(zhì)量胚胎對應(yīng)的卵丘細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ENST00000502521的相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)低質(zhì)胚胎組lncRNA ENST00000502521表達(dá)量較優(yōu)質(zhì)胚胎組明顯升高，說明lncRNA ENST00000502521參與影響卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育。然而，尚不明確其中的調(diào)控機(jī)制。目前對lncRNA調(diào)控機(jī)制的研究主要是通過其位置相關(guān)或鄰近的編碼蛋白的基因。已有研究［12］報道低表達(dá)某一確定lncRNA可導(dǎo)致其附近某些編碼蛋白基因的表達(dá)水平降低。通過基因圖譜分析，lncRNA ENST00000502521屬于內(nèi)在反義lncRNA轉(zhuǎn)錄本，所對應(yīng)的正義轉(zhuǎn)錄本是位于3號染色體上。反義轉(zhuǎn)錄本認(rèn)為在轉(zhuǎn)錄水平、基因印記、X染色體沉默、DNA甲基化、組蛋白修飾等多個水平上起調(diào)控作用［13］。推測該lncRNA可能通過對其靶基因的調(diào)控實現(xiàn)其生物學(xué)功能，對這一問題的闡釋還需要進(jìn)一步研究證實。

IVF患者年齡、體重指數(shù)、基礎(chǔ)性激素水平等因素可能會影響最終的妊娠結(jié)局。本研究通過相關(guān)性分析排除了患者一般情況和lncRNA的表達(dá)水平及妊娠結(jié)局存在相關(guān)性的可能。成功妊娠是反映移植胚胎發(fā)育潛能的重要指標(biāo)。本研究證實，未妊娠組lncRNA ENST00000502521相對表達(dá)量較妊娠組明顯增高。ROC曲線顯示該指標(biāo)預(yù)測妊娠結(jié)局的靈敏度為84.2%，特異性為61.9%；說明卵丘細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ENST00000502521相對表達(dá)量可以作為預(yù)測IVF患者妊娠結(jié)局的分子指標(biāo)。

綜上所述，本研究首次表明人卵丘細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ENST00000502521的表達(dá)水平參與影響卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育，但確切的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。此外，檢測IVF患者卵丘細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ENST00000 502521的相對表達(dá)量可能有助于預(yù)測IVF妊娠結(jié)局。

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The expression of lncRNA ENST00000502521 in human cumulus cells and embryo developmental competence

Li Juan，Cao Yunxia，Liu Tingting，et al
（Reproductive Medicine Center，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

AbstractObjective To explore the expression of lncRNA ENST00000502521 in human cumulus cells of women undergoing in vitro fertilization（IVF）and the relationship between lncRNA ENST00000502521 and oocyte maturation and embryo development.Moreover，its predictive value of IVF outcome was also discussed.Methods The expression of lncRNA ENST00000502521 was measured in 40 pairs of cumulus cells from oocytes resulting in highquality embryo and from oocytes resulting in poor-quality embryo by real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction（qRT-PCR），and further associated these data with embryo developmental potential and competence to establish a pregnancy.The predictive value of the lncRNA ENST00000502521 was evaluated using a receiver operating characteristic（ROC）curve.Results Notably elevated lncRNA ENST00000502521 expression levels were observed in the group poor-quality embryo compared to the group high-quality embryo（P＜0.05）.The relative expression levels of lncRNA ENST00000502521 in the non-pregnancy group were significantly higher than those in the pregnancy group（P＜0.05）.The area under the ROC curve（AUC）of lncRNA ENST00000502521 was 0.71（P＜0.05，95%CI：0.55～0.87）and had a sensitivity of 84.2%and a specificity of 61.9%to predict embryo developmental potential.Conclusion The relative expression levels of lncRNA ENST00000502521 may be considered as potential biomarkers to predict embryo developmental competence and IVF outcome.

Key wordscumulus cells；long noncoding RNAs；ENST00000502521；embryo developmental competence

作者簡介：李 娟，女，碩士研究生；曹云霞，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：caoyunxia6＠126.com

基金項目：國家重大科學(xué)研究計劃（編號：2012CB944704）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0569-04

中圖分類號R 714.2