化學(xué)合成microRNA-21 inhibitors對(duì)大鼠心肌成纖維細(xì)胞活化增殖的影響

張 猛，陶 輝，陳澤文，張家貴，宣海洋，占紅英，石開虎

化學(xué)合成microRNA-21 inhibitors對(duì)大鼠心肌成纖維細(xì)胞活化增殖的影響

張 猛1，2，陶 輝1，2，陳澤文1，2，張家貴1，2，宣海洋1，2，占紅英1，2，石開虎1，2

摘要目的 探究microRNA-21 inhibitors對(duì)大鼠心肌成纖維細(xì)胞活化增殖的影響。方法 應(yīng)用LipofectamineTM2000 Reagent向大鼠心肌成纖維細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染microRNA-21 inhibitors 24、48 h后，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)microRNA-21、I型膠原前膠原A1（Col1A1）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)水平；Western blot法檢測(cè)Col1A1 和α-SMA的表達(dá)水平；MTT法檢測(cè)microRNA-21 inhibitors對(duì)心肌成纖維細(xì)胞活化增殖的影響。結(jié)果 轉(zhuǎn)染microRNA-21 inhibitors的心肌成纖維細(xì)胞中，microRNA-21表達(dá)下調(diào)，Col1A1和α-SMA的表達(dá)下降；轉(zhuǎn)染microRNA-21 inhibitors的心肌成纖維細(xì)胞增殖活性明顯減弱。結(jié)論 microRNA-21 inhibitors可明顯抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖活性，提示microRNA-21是心肌成纖維細(xì)胞活化增殖的潛在靶向分子，有利于為干預(yù)和預(yù)防心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展提供新思路。

關(guān)鍵詞microRNA-21；心肌成纖維細(xì)胞；Col1A1；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白

2015-02-02接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科，合肥 230601

2安徽醫(yī)科大學(xué)心血管病研究中心，合肥 230601

心肌纖維化是指心肌細(xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維過量積聚、膠原含量顯著升高或膠原成分發(fā)生改變的病理過程，是心肌重構(gòu)的一個(gè)重要特征［1-2］。心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）是心肌間質(zhì)的主要構(gòu)成細(xì)胞，其增殖、活化及表型轉(zhuǎn)換為肌成纖維細(xì)胞并合成分泌大量膠原纖維蛋白。CFs的活化增殖是心肌纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。microRNA是一類內(nèi)源性、非編碼、單鏈RNA，參與心血管系統(tǒng)的生理及多種病理過程。microRNA-21在心臟中表達(dá)豐富，而且其生理功能與心肌纖維化密切相關(guān)。microRNA-21在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要的調(diào)節(jié)作用［3］。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)心肌纖維化和microRNA-21進(jìn)行了大量研究，但CFs中microRNA-21的確切作用機(jī)制尚不完全清楚。該實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的CFs為研究對(duì)象，通過觀察microRNA-21 inhibitors轉(zhuǎn)染后CFs的增殖影響、I型膠原前膠原A1（collagen type I alpha 1，Col1A1）及CFs表型轉(zhuǎn)換為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達(dá)變化，為心肌纖維化、心臟重構(gòu)提供新的參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD乳鼠30只，出生1～3 d，8～9 g，清潔級(jí)，購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、MTT相關(guān)試劑（Sigma公司，美國(guó)）；胎牛血清（Gibco公司，英國(guó)）；LipofectamineTM2000 Reagent、TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國(guó)）；microRNA-21 inhibitors、EzOmics miRNA qPCR Detection Primer試劑盒、EzOmics One-Step qPCR試劑盒（Biomic公司，美國(guó)）；ThermoScript RT-PCR試劑盒（Fermentas公司，美國(guó)）；Western blot法相關(guān)一抗（Bioworld Technology公司，美國(guó)）、相關(guān)二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）（Peprotech，美國(guó)）。

1.1.3 主要儀器 NAPCO-6100型細(xì)胞培養(yǎng)箱（SHELLAB公司，美國(guó)）；SW-CJ-IF型超凈工作臺(tái)（蘇州泰安空氣技術(shù)有限公司，中國(guó)）；Sigma3-16K高速離心機(jī)（Sigma公司，美國(guó)）；7800型PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（ABI公司，美國(guó)）；Western blot法相關(guān)設(shè)備（Biorad公司，美國(guó)）；MK3酶標(biāo)儀（雷勃公司，荷蘭）。

1.2 方法

1.2.1 CFs的提取與培養(yǎng) 將SD乳鼠浸泡于75°酒精消毒并處死，在無菌操作臺(tái)上剪取心尖組織，剪碎并用1.25%胰蛋白酶消化分離細(xì)胞，所得全部細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60～90 min，差速貼壁法除去心肌細(xì)胞，剩下的細(xì)胞即為CFs。繼續(xù)培養(yǎng)

細(xì)胞至匯合狀態(tài)，采用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取2～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，在倒置顯微鏡下觀察到可被免疫組化纖維黏連蛋白染色變?yōu)殛?yáng)性者即鑒定為CFs。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)組：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染microRNA-21 inhibitors后的CFs；陰性對(duì)照組：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染microRNA-21 inhibitors陰性對(duì)照后的CFs；空白對(duì)照組：以等量的生理鹽水代替microRNA-21 inhibitors，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CFs。

1.2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染microRNA-21 inhibitors 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CFs進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 d，將各組CFs細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種于24孔板，用無血清不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液稀釋待轉(zhuǎn)染。成熟引物microRNA-21 inhibitors及其陰性對(duì)照由Biomic生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)并合成。miRNA-21 inhibitor的引物序列：5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′。將miRNA-21 inhibitors及其陰性對(duì)照與脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 Reagent混勻，室溫靜置20 min后，加入相應(yīng)各孔細(xì)胞中，37℃、5%CO2保溫箱孵育4～6 h，更換含血清DMEM并用濃度為10 ng／ml的生長(zhǎng)刺激因子TGF-β刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，24、48 h提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA。

1.2.4 總RNA提取和一步法qRT-PCR檢測(cè)microRNA-21 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組CFs中的microRNA-21含量，用ABI RT-PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。采用TRIzol并根據(jù)操作手冊(cè)一步法抽提細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA的濃度和純度，通過計(jì)算吸光度（absorbance，A）A260／A280的比值了解其純度，選取比值在1.8～2.0的RNA樣品進(jìn)行試驗(yàn)。采用EzOmics miRNA qPCR Detection Primer試劑盒與EzOmics One-Step qPCR試劑盒并參照操作手冊(cè)檢測(cè)microRNA-21。反應(yīng)條件：42℃30 min、95 ℃10 min，接著95℃20 s、62℃30 s、72℃30 s共40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增階段條件；95℃15 s、60℃1 min、95℃15 s的溶解曲線階段條件。以U6作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 定量RT-PCR檢測(cè)Col1A1和α-SMA mRNA表達(dá) 各組總RNA用ThermoScript RT-PCR試劑盒并參照操作手冊(cè)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行qRTPCR檢測(cè)。從GenBank中查找引物序列并設(shè)計(jì)合成相應(yīng)引物。α-SMA引物序列：F：5′-TGGCCACTGCTGCTTCCTCTTCTT-3′，R：5′-GGGGCCAGCTTCGTCATACTCCT-3′；Col1A1引物序列：F：5′-TAACTTCTGGACTATTTGCGGACTTTTTGG-3′，R：5′-GTCCAGCCCTCATCCTGGCC-3′；β-actin引物序列：F：5′-ACGGTCAGGTCATCACTATC-3′，R：5′-ACTGTGTTGGCATAGAGGTC-3′。反應(yīng)條件：50℃2 min、95℃10 min，接著95℃20 s、60℃30 s、72℃30 s 共40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增階段條件；95℃15 s、60℃1 min、95℃15 s的溶解曲線階段條件。以β-actin作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)Col1A1和α-SMA蛋白表達(dá) 將提取的各組細(xì)胞蛋白定量，然后通過SDSPAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，加入Col1A1、α-SMA和β-actin一抗孵育過夜，然后加入Col1A1、α-SMA和β-actin二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白條帶，膠片顯影、定影。成像結(jié)果采用Quantity One V 4.6軟件分析，測(cè)定主帶的吸光度值以計(jì)算Col1A1、α-SMA蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組CFs胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基重懸形成細(xì)胞懸液。用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度為1 500個(gè)／孔，鋪于96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，每孔100 μl，共5張96孔板，連續(xù)監(jiān)測(cè)5 d，鋪板過程中要確保每孔加入細(xì)胞數(shù)一致。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從鋪板后第2天開始，培養(yǎng)終止前4 h每孔加入10 μl 5 g／L的MTT，無需換液，4 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO終止反應(yīng)，振蕩器震蕩5～10 min使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定A值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，單變量?jī)山M資料間的比較采用t檢驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析至少重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染microRNA-21 inhibitors對(duì)microRNA-21表達(dá)的影響 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CFs microRNA-21 inhibitors 48 h后，實(shí)驗(yàn)組microRNA-21表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝14.384，P＜0.01；t＝15.290，P＜0.01）。見圖1。

2.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染microRNA-21 inhibitors對(duì)Col1A1 和α-SMA mRNA表達(dá)的影響 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CFs microRNA-21 inhibitors 48 h后，實(shí)驗(yàn)組Col1A1和α-SMA mRNA表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Col1A1：實(shí)驗(yàn)組vs空白對(duì)照組：t＝13.694，P＜0.01；實(shí)驗(yàn)組vs陰性對(duì)照組：t＝14.571，P＜0.01；α-SMA：實(shí)驗(yàn)組vs空白對(duì)照組：t＝5.869，P＜0.01；實(shí)驗(yàn)組vs陰性對(duì)照組：t＝7.286，P

＜0.01）。見圖2。

2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染microRNA-21 inhibitors對(duì)Col1A1 和α-SMA蛋白表達(dá)的影響 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CFs microRNA-21 inhibitors 48 h后，實(shí)驗(yàn)組Col1A1和α-SMA蛋白表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Col1A1：實(shí)驗(yàn)組vs空白對(duì)照組：t＝6.274，P＜0.01；實(shí)驗(yàn)組vs陰性對(duì)照組：t＝7.893，P ＜0.01；α-SMA：實(shí)驗(yàn)組vs空白對(duì)照組：t＝5.869，P ＜0.01；實(shí)驗(yàn)組vs陰性對(duì)照組：t＝14.131，P＜0.01）。見圖3。

2.4 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CFs的細(xì)胞活力 MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CFs microRNA-21 inhibitors 24、48 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Col1A1：實(shí)驗(yàn)組vs空白對(duì)照組：t＝3.764，P＜0.01；實(shí)驗(yàn)組vs陰性對(duì)照組：t＝5.645，P＜0.01；α-SMA：實(shí)驗(yàn)組vs空白對(duì)照組：t＝3.811，P＜0.01；實(shí)驗(yàn)組vs陰性對(duì)照組：t＝4.503，P＜0.01）。見圖4。

3　討論

CFs是心臟組織中數(shù)目最多的細(xì)胞，遍布于心肌組織，包繞心肌細(xì)胞并連接細(xì)胞間質(zhì)，是心肌纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，其過度活化增殖，可分泌大量的膠原纖維，在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用［4-5］。CFs是合成和分泌心肌細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，受刺激后活化，發(fā)生表型和功能的改變，轉(zhuǎn)換為表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞，且過度增殖并積聚大量的細(xì)胞外基質(zhì)，如Col1A1等［6-7］。因此，心肌纖維化主要通過CFs活化增殖并促進(jìn)

Col1A1和α-SMA等的過度表達(dá)，使細(xì)胞外間質(zhì)膠原纖維沉積、膠原含量顯著上升，導(dǎo)致纖維化形成。

文獻(xiàn)［8-9］報(bào)道，microRNA在心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)進(jìn)程中，尤其是在心肌纖維化的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。有許多microRNA可能發(fā)揮調(diào)控心肌纖維化的作用，已經(jīng)證實(shí)的有microRNA-21、microRNA-29、microRNA-133、microRNA-30和microRNA-590等［10］。microRNA-21在心肌纖維化中有關(guān)鍵作用，與心肌纖維化聯(lián)系密切。Thum et al［11-12］發(fā)現(xiàn)，microRNA-21在心肌纖維化中表達(dá)升高，上調(diào)microRNA-21可以刺激EPK-MAP信號(hào)傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的增殖和心肌纖維化。Roy et al［13］證明，在大鼠心肌缺血再灌注模型中，microRNA-21在心肌纖維化和結(jié)構(gòu)重構(gòu)中起關(guān)鍵作用。microRNA-21之所以能夠引起心肌纖維化是因?yàn)樗cCFs有相關(guān)關(guān)系。研究［3］表明microRNA-21可以抑制CFs的凋亡，引起心肌肥大和心肌纖維化的發(fā)生。microRNA-21 inhibitors是microRNA-21的抑制劑，其在CFs活化增殖過程中的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究用microRNA-21 inhibitors轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的新生乳鼠CFs，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CFs的增殖變化以及Col1A1和α-SMA的表達(dá)水平。結(jié)果表明microRNA-21 inhibitors可明顯抑制CFs的增殖活性，降低Col1A1和α-SMA的表達(dá)水平。

綜上所述，microRNA-21 inhibitors轉(zhuǎn)染CFs后，microRNA-21表達(dá)下降，而CFs中microRNA-21的低表達(dá)可以抑制其活化增殖，抑制心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展，表明microRNA-21是CFs活化增殖的潛在靶向分子，可以為干預(yù)和預(yù)防心肌纖維化提供新思路。

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The effect of microRNA-21 inhibitors on proliferation and activation of cardiac fibroblasts in rats

Zhang Meng1，2，Tao Hui1，2，Chen Zewen1，2，et al
（1Dept of Cardio-Thoracic Surgery，The Second Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601；2Dept of Cardiovascular Disease Research Center，Anhui Medical University，Hefei 230601）

AbstractObjective To investigate the effect of microRNA-21 inhibitors on proliferation and activation of cardiac fibroblasts in rats.Methods LipofectamineTM2000 Reagent was used to transfected cardiac fibroblasts with microRNA-21 inhibitors.After 24，48 h，qRT-PCR was applied to assess the expressions of microRNA-21 and mRNA

of Col1A1 and α-SMA.The protein expression levels of Col1A1 and α-SMA were detected by Western blot.MTT assay was used to determine the proliferation influence of the transfected cardiac fibroblasts.Results The cardiac fibroblasts transfected microRNA-21 inhibitors exhibited down-regulated microRNA-21 expression and attenuated Col1A1 and α-SMA mRNA expression.The cardiac fibroblasts proliferation activity decreased significantly after transfected microRNA-21 inhibitors.Conclusion MicroRNA-21 inhibitors can suppress the proliferation activity of cardiac fibroblasts significantly，implicating microRNA-21 as a potential target for cardiac fibroblasts activation and proliferation and pointing out that this result can provide a new idea for intervening and preventing the myocardial fibrosis occurrence and development.

Key wordsmicroRNA-21；cardiac fibroblasts；Col1A1；α-SMA；Western blot

作者簡(jiǎn)介：張 猛，男，碩士研究生；石開虎，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：shikaihu ＠gmail.com

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：1308085MH117、1408085MH175）；安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2011A175、KJ2012Z164）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）05-0577-05

中圖分類號(hào)R 542.23