6-羥基-1-氫-吲唑保護MPP＋誘導凋亡的SH-SY5Y細胞的機制

梁小鳳，朱雯婷，饒進軍，王文雅

6-羥基-1-氫-吲唑保護MPP＋誘導凋亡的SH-SY5Y細胞的機制

梁小鳳1，朱雯婷2，饒進軍1，王文雅1

摘要目的 研究6-羥基-1-氫-吲唑對1-甲基-4-苯基-吡啶離子（MPP＋）誘導凋亡的SH-SY5Y細胞的保護作用機制。方法 體外培養(yǎng)人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y，以200 μmol／L MPP＋誘導SH-SY5Y細胞凋亡建立體外帕金森病細胞模型。Western blot法分別檢測200 μmol／L MPP＋和200 μmol／L MPP＋聯合0.1 μmol／L 6-羥基-1-氫-吲唑作用后SHSY5Y細胞內糖原合酶激酶3β（GSK-3β）、周期依賴性蛋白激酶5（CDK5）以及凋亡蛋白酶3（caspase-3）的活性。結果 200 μmol／L MPP＋作用SH-SY5Y細胞8 h，GSK-3β、CDK5與caspase-3活性升高。200 μmol／L MPP＋聯合0.1 μmol／L 6-羥基-1-氫-吲唑作用SH-SY5Y細胞8 h，GSK-3β、CDK5與caspase-3的活性降低。結論 6-羥基-1-氫-吲唑對MPP＋誘導凋亡的SH-SY5Y細胞的保護機制可能是抑制GSK-3β、CDK5和caspase-3的活性。

關鍵詞6-羥基-1-氫-吲唑；SH-SY5Y細胞；MPP＋；糖原合酶激酶3β；周期依賴性蛋白激酶5；凋亡蛋白酶3

2015-01-20接收

作者單位：1南方醫(yī)科大學藥學院臨床藥理研究所，廣州 510515

2江西省新余市人民醫(yī)院藥劑科，新余 338000

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是位居第二的神經退行性疾病［1］。PD病因未明，主要病理改變是多巴胺能神經元丟失、Lewy-body蛋白沉淀、tau過度磷酸化等［2］。現今主流的治療方案是補充左旋多巴，但左旋多巴不能減緩PD的病程，長期使用療效不佳［3］，這迫使人們尋找新的治療方案。前期工作表明1-甲基-4-苯基-吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP＋）誘導SH-SY5Y細胞凋亡建立的體外PD細胞模型中，6-羥基-1-氫-吲唑可保護多巴胺能神經元和抑制tau磷酸化，但作用的具體信號通路尚不清楚。PD普遍存在tau過度磷酸化［4］，體內磷酸化tau的主要激酶有糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）和周期依賴性蛋白激酶5（cyclin dependent kinase 5，CDK5）［5］。GSK-3β的活性主要通過216位點酪氨酸（Tyr216）和9位點絲氨酸（Ser9）的磷酸化水平調節(jié)，兩位點磷酸化可分別使GSK-3β失活和活化［6］。p25是由p35降解而得，催化CDK5活性的能力比p35強很多，兩者在體內處于動態(tài)平衡，統(tǒng)計p35／p25可檢測CDK5的活性變化［7］。caspase-3是體內調節(jié)神經元凋亡的關鍵蛋白酶［8］，該研究還將檢測該酶的活性變化來探討6-羥基-1-氫-吲唑抑制SH-SY5Y細胞凋亡的可能通路。

1　材料與方法

1.1 細胞 人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y由中山大學中山醫(yī)學院藥理教研室惠贈。

1.2 藥品 高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；6-羥基-1-氫-吲唑、MPP＋（美國Sigma公司）。

1.3 抗體 特異性磷酸化p-GSK-3β（Tyr216）的小鼠多克隆抗體（美國BD公司）；特異性磷酸化p-GSK-3β（Ser9）、CDK5亞基p35／p25蛋白、caspase-3的兔多克隆抗體（美國CST公司）。

1.4 儀器 CEA-800型CO2組織培養(yǎng)箱（美國Forma Scientific公司）；BJ-2CD型超凈工作臺（上海博迅公司）；5810R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；iMark型吸收光酶標儀、PowerPac 300型電泳儀、PowerPac 200型半干轉膜儀（美國BIO-RAD公司）。

1.5 方法

1.5.1 SH-SY5Y細胞培養(yǎng) SH-SY5Y細胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。消化傳代接種在24孔細胞培養(yǎng)板，待細胞貼壁。

1.5.2 MPP＋處理SH-SY5Y細胞 MPP＋用無血清的DMEM培養(yǎng)基配成100×1 mmol／L儲備液，加到培養(yǎng)基中，使終濃度為200 μmol／L，在2、4、8、16和24 h時間點，收集正常對照組、各時間點MPP＋組細胞，通過Western blot法檢測MPP＋對SH-SY5Y細胞內p-GSK-3β（Tyr216）、p-GSK-3β（Ser9）和p35蛋白表達水平影響的時效。

1.5.3 6-羥基-1-氫-吲唑聯合MPP＋處理SH-SY5Y

細胞 在細胞實驗中，6-羥基-1-氫-吲唑用DMSO溶解，配成100 μmol／L的儲備液，直接加到6-羥基-1-氫-吲唑給藥組培養(yǎng)基中，使終濃度為0.1 μmol／L。正常對照組、MPP＋組加入等體積DMSO。2 h后，各組加入MPP＋，培養(yǎng)8 h后，收集各組細胞，使用Western blot法檢測各組細胞p-GSK-3β（Tyr216）、p-GSK-3β（Ser9）、p35、p25和caspase-3的表達水平，用以探討6-羥基-1-氫-吲唑保護MPP＋誘導凋亡的SH-SY5Y細胞的可能作用機制。

1.5.4 Western blot法檢測 棄去24孔板內的培養(yǎng)液，用預冷的PBS漂洗細胞2次，置于冰上，每孔加入150 μl細胞裂解液（SDS 2 g、Tris堿0.757 1 g、溴酚藍0.01 g、DTT 0.771 g、去離子水90 ml、甘油10 ml）裂解20 min，超聲，4℃、1 400 r／min離心10 min，沸水煮5 min，冷卻。BCA法進行蛋白定量后，加入5×上樣緩沖液，上樣，以10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，半干電轉移法轉移至PVDF膜，室溫下用封閉液封閉1 h后加入用封閉液稀釋的一抗4℃震蕩過夜，第2天取出，室溫孵育二抗2 h，ECL顯色液兩種顯色底物1∶1等體積混合，暗室反應1 min，壓膠片曝光，βactin作為內參照。掃描膠片，運用ger-pro analyzer對免疫印跡條帶進行半定量分析，目的蛋白條帶的密度與β-actin相比，用相對光密度（relative optical density，ROD）來表示。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗結果以±s表示，采用One-way ANOVA分析。

2　結果

2.1 MPP＋誘導SH-SY5Y細胞內GSK-3β活性增高 Western blot法結果顯示，200 μmol／L MPP＋處理SH-SY5Y細胞8 h后，GSK-3β Tyr216位點的磷酸化水平明顯比正常對照組高（P＜0.01）；GSK-3β Ser9位點的磷酸化水平則在4 h后開始顯著降低，8 h達到最低水平（P＜0.01）。200 μmol／L MPP＋在8 h可使SH-SY5Y細胞的GSK-3β達到最高活性。見圖1。

2.2 MPP＋誘導SH-SY5Y細胞內CDK5的活性增高 Western blot法結果顯示，200 μmol／L MPP＋處理SH-SY5Y細胞2、4、8、16和24 h后，p35表達明顯比正常對照組低（P＜0.01）。見圖2。

2.3 6-羥基-1-氫-吲唑對MPP＋誘導增高的GSK-3β活性具有抑制作用 因為MPP＋作用8 h對SHSY5Y細胞內GSK-3β和CDK5的活性綜合影響最大，故選擇在此時間點探討6-羥基-1-氫-吲唑抑制MPP＋誘導SH-SY5Y細胞凋亡的作用機制。Western blot法結果顯示，200 μmol／L MPP＋處理SHSY5Y細胞8 h后，GSK-3β（Ser9）磷酸化水平明顯比正常對照組低，GSK-3β Tyr216位點的磷酸化水平明顯比正常對照組高（P＜0.01）。200 μmol／L MPP＋聯合0.1 μmol／L 6-羥基-1-氫-吲唑處理SHSY5Y細胞8 h后，GSK-3β（Ser9）磷酸化水平明顯比200 μmol／L MPP＋處理組高，GSK-3β Tyr216位點的磷酸化水平明顯比200 μmol／L MPP＋處理組低（P＜0.01）。見圖3。

2.4 6-羥基-1-氫-吲唑對MPP＋誘導增高的CDK5

活性具有抑制作用 Western blot法結果顯示，200 μmol／L MPP＋處理SH-SY5Y細胞8 h后，p35／p25的比值明顯比正常對照組低（P＜0.01）。200 μmol／L MPP＋聯合0.1 μmol／L 6-羥基-1-氫-吲唑處理SH-SY5Y細胞8 h后，p35／p25的比值明顯比200 μmol／L MPP＋處理組高（P＜0.01）。見圖4。

2.5 6-羥基-1-氫-吲唑可抑制MPP＋誘導SHSY5Y細胞內凋亡蛋白酶caspase-3的增高 Western blot法結果顯示，200 μmol／L MPP＋處理SHSY5Y細胞8 h后，caspase-3的表達明顯比正常對照組高（P＜0.01）；200 μmol／L MPP＋聯合0.1 μmol／L 6-羥基-1-氫-吲唑處理SH-SY5Y細胞8 h后，caspase-3的表達明顯比200 μmol／L MPP＋處理組低（P＜0.01）。見圖5。

3　討論

MPP＋誘導SH-SY5Y細胞凋亡是現今廣泛用于建立體外研究PD病理機制和篩選新藥的PD細胞模型的方法［9］。雖然PD病因未明，但已有研究［5］表明PD患者體內GSK-3β和CDK5的活性增高，與病因密切相關。GSK-3β是PD中引起神經元凋亡的關鍵性激酶，過度激活可致tau過磷酸化。而tau過磷酸化可導致微管穩(wěn)定性及其有絲分裂功能和維持神經元生長發(fā)育功能異常，由此介導了多巴胺能神經元凋亡［10］。此前的研究［11］證明，Indirubin-3’-oxime和AR-A014418可通過抑制GSK-3β的活性來降低tau過磷酸化，并且由此抑制MPP＋誘導的多巴胺能神經元凋亡。在本研究中，通過Western blot檢測到MPP＋可提高GSK-3β Tyr216的磷酸化水平，

同時抑制Ser9磷酸化水平，以致GSK-3β過度激活，但是6-羥基-1-氫-吲唑降低GSK-3β Tyr216的磷酸化水平的同時也提高了Ser9的磷酸化水平，由此可知6-羥基-1-氫-吲唑可降低MPP＋誘發(fā)升高的GSK-3β活性，可能由此抑制了tau磷酸化，減少多巴胺能神經元的凋亡。實驗中觀察到6-羥基-1-氫-吲唑還可以降低MPP＋誘發(fā)升高的p35／p25比值，抑制CDK5的活性。已有研究［7］證明，CDK5在PD中是異常活躍的，可引起tau過度磷酸化和小神經膠質細胞過度增生。甚至，已發(fā)現過表達CDK5亞基p25的小鼠可致神經退行性疾病和認知障礙，并且其機制為CDK5過度激活導致tau過度磷酸化［12］。由此可知，6-羥基-1-氫-吲唑抑制CDK5的活性，可能進一步降低tau蛋白過磷酸化，保護多巴胺能神經元。

目前，已有研究［13］表明神經退行性疾病普遍存在caspase-3過度激活，從而誘發(fā)神經元凋亡，其具體表現為DNA斷裂、線粒體損傷、神經元退化及其軸突病變，若抑制該酶的活性，依賴此凋亡酶的細胞凋亡途徑將無法正常進行。MPP＋可引起caspase-3的過度激活，促進SH-SY5Y細胞死亡［14］。但是給予6-羥基-1-氫-吲唑預處理后，SH-SY5Y細胞內caspase-3表達量顯著下降，因此抑制caspase-3的活性是6-羥基-1-氫-吲唑保護多巴胺能神經元的另一機制。

綜上所述，6-羥基-1-氫-吲唑保護多巴胺能神經元的機制可能是同時抑制GSK-3β和CDK5活性。此外，6-羥基-1-氫-吲唑還可抑制凋亡蛋白酶caspase-3的活性，這是該化合物保護多巴胺能神經元的另一可能機制。

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The mechanism of 6-hydroxy-1H-indazole’s neuroprotection from MPP＋-induced apoptosis of SH-SY5Y cells

Liang Xiaofeng1，Zhu Wenting2，Rao Jinjun1，et al
（1Institute of Clinical Pharmacology of School of Pharmaceutical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou 510515；2Dept of Pharmacy，Xinyu People’s Hospital in Jiangxi Province，Xinyu 338000）

AbstractObjective To investigate the mechanism of 6-hydroxy-1H-indazole’s neuroprotection from 1-methyl-4-phenylpyridinium（MPP＋）-induced apoptosis of SH-SY5Y cells.Methods The model of Parkinson’s disease in

vitro was built through SH-SY5Y cells’s exposure to 200 μmol／L MPP＋.Cultured SH-SY5Y cells were respectively exposed to 200 μmol／L MPP＋and 200 μmol／L MPP＋combined 0.1 μmol／L 6-hydroxy-1H-indazole，then the variations of activity of glycogen synthase kinase-3β（GSK-3β），cyclin dependent kinase 5（CDK5）and caspase-3 were determined by Western blot.Results 200 μmol／L MPP＋increased the activity of GSK-3β，CDK5 and caspase-3 in SH-SY5Y cells.200 μmol／L MPP＋combined 0.1 μmol／L 6-hydroxy-1H-indazole inhibited the activity of GSK-3β，CDK5 and caspase-3 in SH-SY5Y cells.Conclusion 6-hydroxy-1H-indazole decreases the activity of GSK-3β，CDK5 and caspase-3 to protect SH-SY5Y cells from MPP＋-induced toxicity.

Key words6-hydroxy-1H-indazole；SH-SY5Y cells；MPP＋；GSK-3β；CDK5；caspase-3

作者簡介：梁小鳳，女，碩士研究生；王文雅，女，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：wangwy ＠fimmu.com

基金項目：國家自然科學基金重點項目（編號：81030024）；廣東省自然科學基金（編號：S2012010009368）；廣東省教育部產學研結合項目（編號：2012B091100465）

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0585-05

中圖分類號R 962；R 742.5