LPS對肝癌細胞株HepG2增殖、凋亡及分泌炎癥因子的影響

劉亞婷，李 濤，徐恩君，周 敏，徐元宏，沈繼龍

LPS對肝癌細胞株HepG2增殖、凋亡及分泌炎癥因子的影響

劉亞婷1，李 濤1，徐恩君1，周 敏2，徐元宏1，沈繼龍3

摘要目的 體外觀察不同濃度細菌內(nèi)毒素脂多糖（LPS）對肝癌HepG2細胞增殖、凋亡以及分泌炎癥因子的影響，并探討可能的機制。方法 按照隨機數(shù)字法將細胞分為對照組及1、10、50、100 μg／ml LPS處理組。用MTT檢測刺激24、48、72和96 h后細胞的增殖能力；用流式細胞術(shù)檢測刺激24 h后細胞的凋亡情況；用RT-PCR法檢測刺激24 h后白介素-6（IL-6）和白介素-8（IL-8）mRNA的表達含量；用化學(xué)發(fā)光法檢測刺激24 h后IL-6和IL-8的表達量，最后用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果 與對照組比較，各處理組刺激24 h和48 h后細胞增殖活性明顯升高（P＜0.05），而在72、96 h差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；刺激24 h后，1、10、50和100 μg／ml LPS處理組以及對照組之間的細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；刺激24 h后，與對照組比較，隨著刺激濃度的升高，IL-6和IL-8的表達量明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論 LPS可以在48 h內(nèi)促進HepG2的增殖，對HepG2細胞的凋亡沒有影響，并且LPS作用可以上調(diào)IL-6 和IL-8水平。

關(guān)鍵詞脂多糖；HepG2細胞；增殖；凋亡；炎癥因子

2015-03-10接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1檢驗科、2ICU，3安徽人獸共患病重點實驗室，合肥 230032

肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，在中國城鄉(xiāng)居民的發(fā)病率和死亡率都很高［1］。細菌內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以誘導(dǎo)免疫細胞和炎癥相關(guān)細胞表達分泌大量的細胞因子和炎癥介質(zhì)，參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。臨床研究［2］表明，肝炎患者的血清LPS濃度明顯高于正常人，說明LPS對肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要的影響。該研究探討不同濃度LPS體外刺激肝癌HepG2細胞后，對細胞的增殖、凋亡以及分泌炎癥因子的影響。

1　材料與方法

1.1 材料 HepG2細胞株來自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研中心細胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Thermo公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；MTT試劑購自美國Sigma公司；凋亡試劑盒購自上海貝博公司；脂質(zhì)體Lipofectamine2000、總RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司；引物由上海生工技術(shù)有限公司設(shè)計合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司；2 000 bp DNA Ladder Marker購自日本TaKaRa公司；白介素-6（interleukin-6，IL-6）和白介素-8（interleukin-8，IL-8）試劑盒購自德國西門子公司。

1.2 方法

1.2.1 HepG2細胞培養(yǎng) 應(yīng)用DMEM高糖培養(yǎng)基（添加10%的胎牛血清，1%的青霉素和鏈霉素）于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，細胞貼壁率達80%～90%時用胰酶消化，細胞活率在90%以上進行傳代。

1.2.2 MTT檢測細胞增殖能力 在實驗前1 d，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液制成單細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，按照隨機數(shù)字表法將其分為對照組以及1、10、50、100 μg／ml LPS處理組，使每孔細胞數(shù)為5× 103個，每組5個復(fù)孔。待細胞完全貼壁后，在各組細胞中分別添加0、1、10、50、100 μg／ml的LPS繼續(xù)培養(yǎng)。刺激24、48、72、96 h，各孔加入MTT溶液（5 mg／ml）20 μl，培養(yǎng)4 h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl，震蕩10 min。使結(jié)晶充分溶解，用酶聯(lián)免疫標記分析儀測定490 nm波長的光密度（optical density，OD）值。測各孔的吸光度值，取各組值的均數(shù)表示細胞的增殖情況。以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 在實驗前1 d，將細胞以每孔5×105個接種于6孔板中，分組培養(yǎng)同1.2.2（每組3個復(fù)孔）。將各組細胞培養(yǎng)24 h，胰酶消化后1 000 r／min離心5 min，PBS洗滌2次，按照Annexin V-FITC／PI細胞凋亡檢測試劑盒說

明書步驟操作，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 RT-PCR檢測IL-6、IL-8 mRNA表達 在實驗前1 d，將細胞以每孔5×105個接種于6孔板中，分組培養(yǎng)同1.2.2（每組3個復(fù)孔）。將各組細胞培養(yǎng)24 h，收集各組細胞上清液，TRIzol法提取各組細胞總RNA，cDNA合成按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。PCR擴增：從基因庫中查出IL-6、IL-8的全基因序列，采用Prime Primier 5軟件進行引物設(shè)計，IL-6上游引物：5’-GTCCAGTTGCCTTCTCCC-3’，下游引物：5’-GCCTCTTTGCTGCTTTCA-3’，產(chǎn)物為223 bp，退火溫度56℃；IL-8上游引物：5’-CTTTGTCCATTCCCACTTCTGA-3’，下游引物：5’-TCCCTAACGGTTGCCTTTCTAT-3’，產(chǎn)物為267 bp，退火溫度為56℃；采用β-actin作為內(nèi)參照，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min后，95℃變性30 s，56.4℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。TLR4的反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min后，95℃變性30 s，52.9℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物置于2%的瓊脂糖凝膠電泳（100 V，25 min），采用凝膠成像分析系統(tǒng)對條帶進行掃描分析。

1.2.5 化學(xué)發(fā)光法 -80℃冰箱取出已收集的各組上清液，室溫溶解。按照西門子公司IL-6與IL-8檢測試劑盒說明書步驟操作，利用IMMULITE 1000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測各組上清液中IL-6與IL-8的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，定量資料多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗，定性資料比較采用方差分析。

2　結(jié)果

2.1 不同濃度LPS處理HepG2細胞后在不同時間點對其增殖的影響 刺激24、48 h后，1、10、50、100 μg／ml LPS處理組細胞增殖活性均高于對照組（F＝78.7、121.4，P＜0.05），且隨著濃度的上升，增殖活性也不斷的升高；隨著時間的延長，刺激72、96 h后，各組細胞增殖活性沒有明顯的差異（P＞0.05），見圖1。

2.2 不同濃度LPS處理后對HepG2細胞凋亡能力的影響 刺激24 h后，1、10、50、100 μg／ml LPS處理組以及對照組的細胞凋亡率分別為（2.53± 0.24）%、（2.72±0.32）%、（2.64±0.25）%、（2.89 ±0.42）%、（2.41±0.31）%。組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F＝3.154，P＞0.05）。即不同濃度LPS處理HepG2對其凋亡能力沒有影響，見圖2。

2.3 不同濃度LPS處理HepG2細胞后IL-6、IL-8 mRNA表達 刺激24 h后，以目的基因的灰度值／內(nèi)參的灰度值來表示目的基因的相對表達含量，進行統(tǒng)計學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，隨著刺激濃度的升高，IL-6、IL-8 mRNA的相對表達含量有明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

2.4 不同濃度LPS對HepG2釋放細胞因子IL-6 和IL-8的影響 不同濃度LPS在刺激HepG2細胞24 h后，細胞釋放的IL-6和IL-8的量與對照組相比顯著升高（P＜0.05），并且隨著濃度的增大，IL-6和IL-8的量也逐漸升高，見表1。

表1　化學(xué)發(fā)光法檢測不同濃度LPS刺激HepG2后IL-6和IL-8的表達量（pg／ml，±s）

表1　化學(xué)發(fā)光法檢測不同濃度LPS刺激HepG2后IL-6和IL-8的表達量（pg／ml，±s）

細胞因子　LPS的濃度（μg／ml）0 1 10　50　100　F值　P值IL-6　11.3±2.7　21.4±2.9　30.2±1.8　40.7±3.2　48.5±2.1　419.44　0.00 IL-8　14.2±1.3　29.3±3.4　41.5±1.9　47.8±2.9　54.2±1.6　357.71　0.00

3　討論

慢性炎癥在不同器官如肺、結(jié)腸和肝臟腫瘤的發(fā)生過程中起著至關(guān)重要的作用［3］。在慢性乙肝疾病患者中LPS往往有較高表達。LPS是革蘭陰性細菌細胞壁的主要組成成分，對LPS的識別與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是機體自身防御反應(yīng)的一個重要環(huán)節(jié)，也是導(dǎo)致內(nèi)毒素性休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能衰竭等疾病的重要機制。研究［4］已經(jīng)證實LPS主要是通過TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活胞內(nèi)信號分子，影響其生物學(xué)特性。由于TLR4在HepG2細胞上也有表達，所以本研究可以直接用LPS處理來觀察其對HepG2細胞的一些作用。

已有報道［5］指出，LPS可以誘導(dǎo)腫瘤細胞TLR4信號系統(tǒng)的激活，促進肝癌細胞的細胞生存和增殖。本研究用MTT法檢測不同時間及濃度下LPS刺激后細胞的增殖能力，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24 h和48 h后，隨著LPS濃度的增高，細胞的增殖能力也不斷提高，且呈劑量依賴性。而隨著細胞培養(yǎng)時間繼續(xù)延長，細胞增殖能力沒有太大的影響，而在培養(yǎng)96 h時，LPS的刺激反而對HepG2細胞的增殖有一定抑制作用。可能的原因是在不同的時間節(jié)點和不同的LPS刺激濃度下，LPS激活的主要信號途徑可能并不相同，誘導(dǎo)的相關(guān)因子表達也不一樣，以至于對細胞增殖的效應(yīng)出現(xiàn)變化。對此，本研究又分別通過RT-PCR及化學(xué)發(fā)光法檢測了兩種重要炎癥因子IL-6、IL-8的表達情況，發(fā)現(xiàn)不同濃度LPS在刺激HepG2細胞24 h后，細胞釋放的IL-6和IL-8的量與對照組相比顯著升高，并且隨著濃度的增大，IL-6 和IL-8的量也逐漸升高。由于IL-6和IL-8不僅可以作為重要炎癥因子調(diào)節(jié)機體的免疫反應(yīng)，還能夠提高多種細胞的增殖能力。可能是IL-6和IL-8在LPS對肝癌細胞的增殖調(diào)節(jié)過程中扮演了一定的角色。LPS還能夠刺激巨噬細胞等炎性細胞分泌一些因子，激活先天免疫反應(yīng)，同時它還能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細胞、皮細胞等多種細胞發(fā)生凋亡。本研究用流式細胞術(shù)檢測了各LPS處理組及對照組24 h HepG2細

胞的凋亡情況，顯示不同濃度LPS處理HepG2對其凋亡能力沒有影響，這與金生等［6］的研究一致。可能是由于各組LPS的濃度還未達到能夠使HepG2細胞凋亡的程度，也可能是由于不同濃度的LPS激活了不同的增殖、凋亡信號途徑，最終使得各個處理組及對照組的凋亡率沒有明顯差異。

LPS可以通過刺激炎癥細胞來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中細胞因子水平，誘導(dǎo)腫瘤細胞增殖，促進血管生成、腫瘤入侵及轉(zhuǎn)移［7］。本研究以LPS刺激對人肝癌細胞株HepG2增殖、凋亡及釋放細胞因子的影響展開研究，為明確LPS在肝癌中發(fā)揮的作用及發(fā)揮作用的可能機制提供了實驗和理論依據(jù)。

參考文獻

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Effects of LPS on proliferation，apoptosis and secretion of cytokines of hepatocellular carcinoma cell line HepG2

Liu Yating，Li Tao，Xu Enjun，et al
（Dept of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

AbstractObjective To observe the effects of different concentrations of LPS on proliferation，apoptosis and secretion of cytokines of liver cancer cell line HepG2 in vitro，and to explore their possible mechanism.Methods The cells were divided into control group and 1，10，50，100 μg／ml LPS treatment groups according to the method of random number.The proliferation of HepG2 cells at post treatment hour（PTH）24，48，72 and 96（denoted as absorption value）was detected by MTT and the apoptosis of HepG2 cells at PTH 24 was detected by flow cytometer.The level of IL-6 and IL-8 mRNA was detected by RT-PCR at PTH 24 and the concentration of IL-6 and IL-8 was detected at PTH 24 by chemiluminescence immunoassay.The data were analyzed with SPSS19.0.Results

Compared with the control group，proliferation of HepG2 cells was significantly increased（P＜0.05）in the treatment groups at PTH 24 and 48，but there was no statistically significant difference in proliferation of HepG2 cells at PTH 72 and 96（P＞0.05）.There was no statistically significant difference in apoptosis rate of HepG2 cells at PTH 24 between the groups.Compared with the control group，the expression of IL-6 and IL-8 was significantly increased with the increase in concentration of LPS at PTH 24.Conclusion LPS can promote the proliferation of HepG2 cells in 48 hours and has no effect on apoptosis of HepG2 cells.LPS can also up-regulate the expression of IL-6 and IL-8 in HepG2 cells.

Key wordslipopolysaccharide；HepG2 cells；proliferation；apoptosis；inflammatory cytokines

作者簡介：劉亞婷，女，碩士研究生；李 濤，男，副教授，副主任技師，碩士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：limedical1974＠126.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：30801088、81201488）；衛(wèi)生部應(yīng)用研究項目“高通量ELISA檢測系統(tǒng)化、標準化系列研究”（編號：28-1-50）

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0604-04

中圖分類號R 73-3