塞來昔布對人成骨細胞增殖的影響及其作用機制

高 杰，桂斌捷，胡孔足，王斯晟

塞來昔布對人成骨細胞增殖的影響及其作用機制

高 杰，桂斌捷，胡孔足，王斯晟

摘要目的 觀察塞來昔布對人成骨細胞增殖的影響及其作用機制。方法 將人成骨細胞分為3個組：空白對照組、IL-1刺激組（陰性對照組）、塞來昔布＋IL-1刺激組（藥物干預組），用RT-PCR法和Western blot法分別檢測三組成骨細胞環氧化酶-2（COX-2）、膜相關前列腺素E2合成酶1 （mPGES-1）mRNA和蛋白的表達。MTT法檢測塞來昔布對陰性對照組人成骨細胞增殖的影響。結果 RT-PCR法和Western blot法實驗結果顯示，同空白對照組相比，陰性對照組的人成骨細胞中COX-2、mPGES-1 mRNA和蛋白的表達均增加；同陰性對照組相比，藥物干預組的COX-2、mPGES-1 mRNA和蛋白的表達均降低。塞來昔布對IL-1刺激的人成骨細胞的生長具有抑制作用，呈現劑量依賴性，濃度越大，抑制作用越大；并且隨著作用時間的延長，細胞的抑制作用增大。結論 塞來昔布可以抑制炎性狀態下人成骨細胞的生長，可能是通過調控COX-2、mPGES-1 mRNA和蛋白的表達，使其表達下調而發揮作用。

關鍵詞環氧化酶-2；塞來昔布；成骨細胞；異位骨化

2015-03-09接收

作者單位：安徽醫科大學第一附屬醫院骨科，合肥 230000

異位骨化是指在軟組織出現成骨細胞，并形成骨組織。研究［1-2］表明環氧化酶-2（cyclooxyenase-2，COX-2）和膜相關前列腺素E2合成酶（membraneassociated PEG2 synthase，mPGES-1）是花生四烯酸生成前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）過程的重要催化酶，PGE2可以讓原始的間充質干細胞誘導分化成成骨細胞，促進成骨細胞的生長，并能調節破骨細胞的分化和功能，提示COX-2和mPGES-1可能對異位骨化的形成發揮重要作用。研究［3-4］表明IL-1能夠刺激人成骨細胞的COX-2及mPGES-1的表達，參與細胞病理及炎性過程。該研究用COX-2選擇性抑制劑塞來昔布抑制COX-2和mPGES-1的表達，減少PGE2的生成，研究塞來昔布在炎性狀態下對成骨細胞中COX-2、mPGES-1 mRNA和蛋白表達的影響，同時觀察不同濃度的塞來昔布對炎性狀態下成骨細胞增殖的影響，探討COX-2和mPGES-1對成骨細胞增殖分化的作用和對異位骨化可能的影響，旨在為臨床預防和治療異位骨化提供新的理論依據。

1　材料與方法

1.1 材料 人成骨細胞購自中科院上海細胞庫；塞來昔布購自中國輝瑞制藥有限公司；無水乙醇溶液、氯仿、異丙醇、甲醇溶液、甘氨酸均購自上海國藥集團；白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、DMEM高糖培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自杭州四季青生物材料有限公司；胰蛋白酶購自上海碧云天生物技術有限公司。PBS為本實驗室自己配置，TRIzol試劑購自美國Invitrogen生物公司，逆轉錄試劑盒及RT-PCR試劑盒均購自Sigma生物試劑公司；COX-2和mPGES-1單抗均購自美國Proteintech Group公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和鼠、兔二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Marker購自美國Thermo Scientific公司；BCA蛋白定量試劑盒購自原平皓生物技術有限公司。

1.2 主要儀器 穩壓穩流蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司；ELX-800型光吸收酶標儀購自美國Bio-Tek公司；PCR擴增儀購自德國Biomatra公司；凝膠密度掃描儀、紫外投射儀均購自上海Tanon科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 人成骨細胞培養于DMEM培養液（90%）和胎牛血清（10%）混合培養基中貼壁生長，在5%CO2、37℃的溫箱中培養。2～3 d傳代一次，使保持細胞處于對數生長期。

1.3.2 RT-PCR法檢測塞來昔布對成骨細胞增殖的影響 實驗將處于對數生長期的人成骨細胞用胰酶消化后，用DMEM培養基配制成細胞密度為1× 105個／ml的細胞懸液分別加入到6孔板中，待細胞貼壁后將其分為3組：空白對照組、IL-1刺激組（陰性對照組）、塞來昔布＋IL-1刺激組（藥物干預組），IL-1的濃度為10 ng／ml，塞來昔布的濃度為20

μmol／L，處理24 h后，取出處理的人成骨細胞，棄培養液，加PBS輕輕地洗滌3遍，吸凈PBS，加入TRIzol，以10 cm2／ml為標準。放置10 min使細胞充分裂解，然后經氯仿處理，異丙醇沉淀，75%乙醇溶液洗滌，干燥，加入20 μl的DEPC水將沉淀溶解，利用紫外分光光度計測量RNA的濃度及OD260／OD280的比值，比值一般在1.8～2.0表示RNA的質量好，可以用于下一步的實驗。取質量好的RNA按照TaKaRa逆轉錄試劑盒的說明配置逆轉錄反應液，將RNA逆轉錄為cDNA。測量cDNA的濃度，計算3組的cDNA總量，將要進行RT-PCR的3組cDNA總量保持一致。RT-PCR按25 μl反應體系進行。COX-2 mRNA上游引物：5’-TTCGGGAGCACAACAGAGTG-3’，下游引物：5’-TAACCGCTCAGGTGTTGCAC-3’；mPGES-1 mRNA上游引物：5’-TAGCCATATTGGAGATGCTGTGG-3’，下游引物：5’-TCAGAGCAAAAGTTAGCTGAACTGG-3’；上游引物：5’-GCCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3’，GAPDH下游引物：5’-GAAGGCAGCCCTGGTAACC-3’。反應條件：95℃預變性15 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產物于1.5%的瓊脂糖凝膠板穩壓電泳（120 V／100 Ma，40 min），經數碼凝膠圖像定量分析系統及凝膠密度掃描機成像處理系統成像、條帶密度掃描。

1.3.3 Western blot法檢測塞來昔布對成骨細胞增殖的影響 將處于對數生長期的人成骨細胞轉移到3張6孔板中，依次將3張培養板分為3組：空白對照組、IL-1刺激組（陰性對照組）、塞來昔布＋IL-1刺激組（藥物干預組），加藥24 h后收集細胞，加入適量的細胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃離心30 min，提取蛋白。以BCA法進行蛋白定量，120℃蛋白變性5 min，每組的蛋白上樣量為20 μg，上樣后用120 V電泳45 min，然后用100 V轉膜1 h，含5%脫脂牛奶TBST液封閉2 h，孵育COX-2和mPGES-1單抗4℃過夜，TBST清洗3次，每次15 min。加入辣根酶標記的鼠或兔二抗孵育1 h，TBST清洗干凈后，于曝光儀中涂上發光劑曝光，并保存圖像。

1.3.4 MTT法檢測塞來昔布對成骨細胞增殖的影響 取生長狀態良好的人成骨細胞于6孔板中，加入濃度為10 ng／ml的IL-1處理細胞，繼續培養24 h后，調整細胞密度為5×104個／ml，接種到96孔板中，每孔加入細胞懸浮液100 μl，過夜培養。待細胞生長至80%～90%細胞密度時，在實驗組的每孔中加入不同濃度的COX-2抑制劑塞來昔布，分別干預24、48 h（以上每個組設置4個復孔），同時設置調零孔和不加藥物干預的空白對照孔。塞來昔布的濃度分別為（0、20、40、60、80、100 μmol／L），在培養板的每孔加入20 μl的MTT（5 mg／ml），37℃條件下避光孵育4 h后結束培養，小心的吸去上清液，每孔加入150 μl DMSO，在搖床上低速振蕩15 min，使孔內的結晶充分溶解后，在酶聯免疫酶標儀上測定570 nm波長處各孔光密度（optical density，OD）值，取4個復孔的平均值。按照以下公式計算細胞的抑制率：細胞增殖抑制率（%）＝（1-OD實驗組平均值／OD對照組平均值）×100%。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件進行分析，實驗數據采用±s表示，單變量兩組之間的比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。

2　結果

2.1 塞來昔布對成骨細胞中COX-2 mRNA、mPGES-1 mRNA表達的影響 所有陰性對照組、陽性對照組、藥物干預組的成骨細胞經TRIzol裂解提取后進行RNA檢測。總RNA經紫外分光光度計測量，各組OD260／OD280為1.8～2.0，RNA質量較好，表明無DNA和蛋白質污染，OD230／OD260為1.2～1.6，表明鹽離子清洗干凈，殘留較少。RT-PCR檢測3組細胞的COX-2、mPGES-1 mRNA的表達結果顯示：IL刺激人成骨細胞后，細胞內的COX-2、mPGES-1 mRNA的表達增加；塞來昔布作用于IL-1刺激組的人成骨細胞使COX-2、mPGES-1 mRNA的表達降低，見圖1。

2.2 塞來昔布對成骨細胞中COX-2、mPGES-1蛋白表達的影響 同空白對照組相比，陰性對照組成骨細胞中COX-2、mPGES-1蛋白表達增加；同陰性對照組相比，藥物干預組COX-2、mPGES-1蛋白表達降低（F1＝1.54、F2＝2.92，P＜0.05）。見圖2。

2.3 塞來昔布對成骨細胞增殖的影響 實驗結果顯示塞來昔布對炎性狀態下人成骨細胞的增殖具有抑制作用，48 h的細胞增殖抑制率高于24 h的細胞增殖抑制率；不同濃度的塞來昔布作用于成骨細胞表現為隨著塞來昔布濃度的增加，其抑制率呈上升趨勢，差異具有統計學意義（F＝22.86，P＜0.05），見表1、圖3。

表1　不同濃度的塞來昔布分別在24 h和48 h對成骨細胞生長的影響（±s）

表1　不同濃度的塞來昔布分別在24 h和48 h對成骨細胞生長的影響（±s）

與48 h比較：*P＜0.05

塞來昔布濃度（μmol／L）24 h OD570　　抑制率（%）48 h OD570　　抑制率（%）0　1.02±0.26　0　1.16±0.34　0 20　0.95±0.19　6.86±0.84*　1.02±0.26 11.65±2.00 40　0.83±0.13 18.80±1.67*　0.89±0.30 23.44±3.22 60　0.74±0.22 31.25±2.61*　0.71±0.06 38.96±3.75 80　0.62±0.31 39.70±3.50*　0.61±0.73 47.53±2.36 100　0.54±0.17 46.88±2.25*0.53±0.40 54.20±2.28

3　討論

絕大部分組織細胞COX-2在正常情況下的表達很低，在炎癥、創傷等多種刺激因子作用下可以誘導其高表達［5-6］，并且mPGES-1受COX-2誘導產生高表達。研究［7-8］表明COX-2和mPGES-1是花生四烯酸生成PGE2過程的重要催化酶，PGE2可以讓原始的間充質干細胞誘導分化成成骨細胞，促進成骨細胞的生長，并能調節破骨細胞的分化和功能。研究［9-10］顯示異位骨化是一種病理性的骨形成，多由創傷、感染等刺激誘發多見，成骨細胞在炎癥狀態下的COX-2高表達，提示COX-2和mPGES-1可能對異位骨化的形成發揮重要作用。COX-2選擇性抑制劑能夠選擇性地抑制COX-2的活性和mPGES-1表達，從而減少其生成，PGE2的合成減少進一步使成骨細胞的分化和生成降低。研究［11］顯示，塞來昔布能夠逆轉PGE2引起的糖蛋白降解及抑制糖蛋白合成的作用，保護機體糖蛋白。因此，從多方面多角度抑制PGE2的合成，從而抑制成骨細胞的分化和過度增殖，成為臨床治療患者異位骨化的重要途徑。本研究顯示同空白對照組相比，陰性對照組COX-2、mPGES-l mRNA和蛋白表達增加；同陰性對照組相

比，塞來昔布干預組COX-2、mPGES-1 mRNA和蛋白表達下調，表明IL-1刺激成骨細胞中的COX-2、mPGES-1表達增高，而塞來昔布能夠明顯抑制COX-2、mPGES-1在炎性狀態下的成骨細胞的表達，從而能夠抑制PGE2的合成，達到抑制人成骨細胞的生成和分化作用。同時本實驗用MTT法觀察不同濃度不同時間點的塞來昔布是否能影響IL-1刺激的高表達COX-2、mPGES-1的人成骨細胞的生長，實驗結果顯示塞來昔布對高表達COX-2、mPGES-1的人成骨細胞的生長具有抑制作用，隨著時間的延長，成骨細胞的增殖率越來越低，48 h的細胞增殖抑制率高于24 h的細胞增殖抑制率；而不同濃度的塞來昔布作用于成骨細胞表現為隨著塞來昔布濃度的增加，其增殖抑制率呈上升趨勢。

綜上所述，塞來昔布能夠抑制人成骨細胞的生長，可能與其通過抑制COX-2、mPGE-1 mRNA和蛋白表達從而抑制成骨細胞的分化和增殖有關，為臨床異位骨化的治療與研究提供依據。

參考文獻

［1］ Sha W，Olesch C，Hanaka H，et al.Necrosis in DU145 prostate cancer spheroids induces COX-2／mPGES-1 derived PGE2 to promote tumor growth and to inhibit T cell activation［J］.Int J Cancer，2013，133（7）：1578-88.

［2］ Zhang C，Li C，Sui F，et al.Cinnamaldehyde decreases interleukin-1 beta induced PGE2 production by down-regulation of mPGES-1 and COX-2 expression in mouse macrophage RAW264.7 cells［J］.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2012，37（9）：1274-8.

［3］ Leclerc P，Whmaa H，Idborg H，et al.IL-1β／HMGB1 complexes promote the PGE2 biosynthesis pathway in synovial fibroblasts ［J］.Scand J Immunol，2013，77（5）：350-60.

［4］ Parazzoli S，Harmon J S，Vallerie S N，et al.Cyclooxygenase-2，not microsomal prostaglandin Esynthase-1，is the mechanism for interleukin-1β induced prostaglandin E2 production and inhibition of insulin secretion in pancreatic islets［J］.J Biol Chem，2012，287（38）：32246-53.

［5］ Rapuano B E，Boursiquot T E，et al.The efects of COX-1 and COX-2 inhibitors on prostag-l and in synthesis and the formation ofheterotopic bone in a rat model［J］.ArchOrthop Trauma Surg，2008，128（3）：333-4.

［6］ Millanta F，Asproni P，Cancedda S，et al.Immunohistochemical expression of COX-2，mPGES and EP2 receptor in normal and reactive canine bone and in canine osteosarcoma［J］.J Comp Pathol，2012，147（2-3）：153-60.

［7］ Roy K R，Reddy G V，Maitreyi L，et al.Celecoxib inhibits MDR1 expression through COX-2-dependent mechanism in human hepatocellular carcinoma（HepG2）cell line［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2010，65（5）：903-11.

［8］ Zhang K，Wang L，Zhang S，et al.Celecoxib inhibits the heterotopic ossification in the rat model with Achilles tenotomy［J］.Eur J Orthop Surg Traumatol，2013，23（2）：145-8.

［9］ Nauth A，Giles E，Potter B K，et al.Heterotopic ossification in orthopaedic trauma［J］.J Orthop Trauma，2012，26（12）：684-8.

［10］Tannous O，Stall A C，Griffith C，et al.Hete rotopic bone formation about the hip undergoes endochondral ossification：a rabbit model［J］.Clin Orthop Relat Res，2013，471（5）：1584-92.

［11］Mastbergen S C，Bijlsma J W，Lafeber F P.Synthesis and release of human cartilage matrix proteoglycans are differently regulated by nitric oxide and prostaglandin-E2［J］.Ann Rheum Dis，2008，67 （1）：52-8.

Study on the impact of celecoxib on proliferation of human osteoblasts

Gao Jie，Gui Binjie，Hu Kongzu，et al
（Dept of Orthopaedics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

AbstractObjective To study the impact of celecoxib on proliferation of human osteoblasts.Methods The human osteoblasts were cultured and divided into three groups，including the negative control，positive control（stimulated by IL-1）and intervention group（celecoxib＋IL-1）.The detection of mRNA and protein level of COX-2 and mPGES-1 were measured by real tmie PCR（RT-PCR）and Western blot.MTT assay was performed to determine the impact of celecoxib on proliferation of human osteoblasts which were treated with IL-1.Results RT-PCR and Western blot showed that the detection of mRNA and protein level of COX-2 and mPGES-1 of the positive control （stimulated by IL-1）were significantly higher than that of the negative control and intervention group（celecoxib＋IL-1）.Celecoxib had cytotoxic effect on the growth of osteoblasts，manifests dose dependence as well as increasing cell inhibition over time.Conclusion Celecoxib could inhibit proliferation of osteoblasts，and could inhibit the occurrence of heterotopic ossification by regulating the level of mPGES-1 and COX-2 mRNA and protein.

Key wordsCOX-2；celecoxib；osteoblasts；heterotopic ossification

作者簡介：高 杰，男，碩士研究生；桂斌捷，男，教授，副主任醫師，碩士生導師，責任作者；E-mai：guibinjie12＠163.com

基金項目：安徽省自然科學基金（編號：1408085MH182）

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0608-04

中圖分類號R 681.8