兒童狼瘡性腎炎患者中EB病毒潛伏膜蛋白1的表達

丁 艷，廖 旺，向 偉，楊慧蘭，何小解，黨西強，易著文

兒童狼瘡性腎炎患者中EB病毒潛伏膜蛋白1的表達

丁 艷1，2，廖 旺1，向 偉2，楊慧蘭3，何小解4，黨西強4，易著文4

摘要目的 通過實時定量逆轉錄PCR（RT-PCR）、腎臟免疫組化和ELISA 3種方法研究兒童狼瘡性腎炎（LN）中EB病毒（EBV）潛伏膜蛋白1（LMP-1）的表達，試圖探討LMP-1在兒童LN中的致病機制。方法 41例LN患兒和12例健康對照組，分別用RT-PCR法、免疫組化法、ELISA法檢測兩組外周血單核細胞（PBMCs）、腎臟組織及血清中LMP-1的表達。結果 ①RT-PCR法、免疫組化法、ELISA法檢測LN患兒和健康對照者的陽性率分別為65.9%vs 8.3%，95.1% vs 16.7%，22.0%vs 8.3%，差異有統計學意義（P＜0.05）；②3種方法檢測LMP-1的表達，免疫組化法檢測陽性率高于其他兩種方法，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 兒童LN中存在EBV潛伏期基因LMP-1表達異常，其中腎臟組織中表達陽性率最高，提示LMP-1可能參與了兒童LN的發病。

關鍵詞兒童；狼瘡性腎炎；潛伏膜蛋白1；EB病毒

2015-02-02接收

作者單位：1海南省人民醫院皮膚科，海口 570102

2海南省婦幼保健院皮膚科，海口 570206

3廣州軍區廣州總醫院皮膚科，廣州 510010

4中南大學湘雅二醫院兒童醫學中心小兒腎臟專科，長沙410011

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是累及全身多系統的自身免疫性疾病，表現為T、B淋巴細胞異常活化和大量自身抗體產生［1］。兒童SLE通常臨床表現較嚴重，起病時急而重，是兒童時期預后較差的一種疾病。SLE患者幾乎100%腎活檢發現有腎臟受累，其中45%～85%有腎損害臨床表現，兒童狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）比成人更普遍、更嚴重［2-3］。近年來EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染與SLE發生發展的關系已成為SLE研究的熱點［4-5］。EBV具有嗜B淋巴細胞的特性，可終生潛伏于B淋巴細胞，對機體免疫系統造成持續和慢性刺激。EBV基因編碼的抗原和SLE患者的自身抗原有較高的同源性，有誘發自身免疫的可能［5］。該研究通過實時定量逆轉錄PCR（RTPCR）、腎臟免疫組化和ELISA 3種方法研究兒童LN中EBV潛伏期基因之潛伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP-1）的表達，試圖探討LMP-1在兒童LN中的致病機制。

1　材料與方法

1.1 病例資料 實驗組來源于海南省婦幼保健院皮膚科與中南大學湘雅二醫院兒童醫學中心小兒腎臟專科，選取了2009年1月～2013年11月收治的LN患兒41例，其中女30例，男11例；年齡6～16 （11.1±2.4）歲。SLE的診斷依據為1982年美國風濕病協會修正的診斷標準［6］，診斷為SLE基礎上行腎穿刺活檢確診為LN。12例健康對照組腎臟組織及靜脈血均來自海南省婦幼保健院小兒外科急診創傷的患兒，患兒及患兒家族中無自身免疫性疾病史。其中女8例，男4例，年齡7～17（12.3±3.3）歲。實驗組和對照組的年齡經t檢驗顯示差異無統計學意義，性別構成比比較采用χ2檢驗，兩組間差異無統計學意義。本研究通過海南省婦幼保健院和中南大學湘雅二醫院倫理委員會的批準，每個患兒家屬均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法檢測LMP-1基因的表達 細胞分離及RNA提取：抽取LN患兒及健康對照組肝素抗凝靜脈血10 ml。用淋巴細胞分離液常規分離外周血單核細胞（PBMCs），用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）提取RNA。cDNA合成采用逆轉錄試劑盒（美國Fermentans公司），反應體系：1～5 μg RNA，5×Reaction Buffer 5 μl，2.5 U／μl Poly A Polymerase 1 μl，RT Mix 1 μl，總體積25 μl，37℃反應1 h，85℃5 min。實時PCR：采用Icycler IQ實時熒光定量PCR儀（美國Bio-rad公司）檢測EBV基因LMP1的表達。引物序列由上海博亞生物技術有限公司合成，LMP1上游引物：5’-TTGGTGTACTCCTACTGATGATCACC-3’，下游引物：5’-AGTAGATCCAGATACCTAAGACAAGT-3’；PCR反應體

積為20 μl，反應體系為2×SYBR Green qPCR Mix 10 μl，（10 μmol／L）上下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，無酶水7 μl。PCR反應條件為：95℃預變性3 min，之后每一步95℃變性10 s，引物58℃退火延伸30 s，共進行35個循環。采用標準曲線相對定量法進行結果分析。

1.2.2 免疫組化法檢測腎臟組織中LMP-1的表達

腎臟組織塊經固定、石蠟包埋、脫蠟、水化及高溫高壓抗原修復等前期處理后，PBS緩沖液洗片3次，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育10～15 min。滴加一抗（此實驗中一抗無需稀釋）100 μl，置于濕盒內，4℃過夜。滴加生物素標記羊抗鼠二抗工作液，室溫孵育10～15 min。滴加HRP標記鏈霉親和素，室溫孵育10～15 min。PBS漂洗后DAB顯色，在顯微鏡下觀察染色程度；蘇木精復染（30 s～2 min），1%鹽酸酒精分化（1 s）；自來水沖洗10～15 min；烘干后中性樹膠封片，鏡檢。在均一條件下隨機選取切片的5個視野拍照（×200）。

1.2.3 ELISA法檢測血清中LMP-1抗體的水平ELISA試劑盒購于上海藍基公司，嚴格按照說明書操作。結果判定：置酶標450 nm波長處測定樣本吸光度（optical density，OD）值，根據標準品制定的標準曲線換算出各樣本濃度。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析。計數陽性率使用百分比表示，計數資料比較采用χ2檢驗或使用Fisher精確概率法。

2　結果

2.1 RT-PCR法檢測LMP-1基因的表達 RTPCR法檢測41例LN患兒和12例健康對照者，發現27例（65.9%）患兒和1例（8.3%）健康對照者PBMCs中LMP-1基因表達呈陽性，LN患兒的LMP-1基因表達的陽性率與健康對照者相比，差異有統計學意義（χ2＝10.12，P＜0.05）。見圖1。

2.2 免疫組化法檢測LN患兒腎臟組織中LMP-1的表達 41例LN患兒和12例健康對照者腎臟組織中LMP-1蛋白表達結果如下：39例（95.1%）LN患兒和2例（16.7%）健康對照者表達呈陽性，LN患兒腎臟的LMP-1表達的陽性率與健康對照者相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 ELISA法檢測血清中LMP-1蛋白水平 41 例LN患兒和12例健康對照者血清中LMP-1抗體的表達結果如下：9例（22.0%）LN患兒和1例（8.3%）健康對照者呈陽性表達，LN患兒血清的LMP-1抗體表達的陽性率與健康對照者相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 3種方法檢測LN患兒LMP-1表達陽性率的比較 3種方法檢測LN患兒EBV潛伏期基因LMP-1的表達，其檢出陽性率比較差異有統計學意義（χ2＝26.971，P＝0.000）：免疫組化法和ELISA法的檢出陽性率比較，差異有統計學意義（χ2＝42.260，P＜0.001），免疫組化法和RT-PCR法的檢出陽性率比較，差異有統計學意義（χ2＝9.400，P＝0.002）。見表1。

表1　不同檢測方法檢測41例LN患兒LMP-1情況比較

3　討論

國內外的大量研究［4-5］表明，SLE患者中EBV血清學陽性率、病毒載量及EBV基因的表達都顯著高于健康對照者，提示EBV在SLE的發病中起著重要的作用。EBV在感染B淋巴細胞后，表達多種潛

伏蛋白，LMP-1是其中一種，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，是一種跨膜蛋白，通過激活相關信號傳導通路介導細胞異常生物學行為。LMP1提供替代B細胞的存活和分化的信號［5］。國外的研究［7-8］表明，LMP-1能夠通過多種機制加重SLE的自身反應性，包括直接激活B細胞，增強B細胞活化的協同刺激信號，刺激B細胞活化因子（BAFF）的產生，能夠協助打破自我耐受等［9］。本研究通過RT-PCR、免疫組化法和ELISA法檢測均發現兒童LN的LMP-1的表達顯著增加，提示LMP-1在兒童LN中可能起到重要的致病作用。

James et al［10］發現99%的SLE患者為EBV血清學陽性，Yu et al［11］報道SLE患者外周血中有81.6%為EBV DNA陽性，而健康對照者只有48.9%陽性，本研究顯示使用ELISA法檢測LN患兒血清中LMP-1蛋白的表達，僅有22%的陽性率，RTPCR法檢測LN患兒血液中LMP-1基因表達，僅有65.9%的陽性率，均低于國外的研究。考慮可能原因是：①國外EBV血清學研究是針對EBV殼抗原（VCA）的抗體研究，存在敏感性高但特異性較低的問題。②本實驗是針對LMP-1 DNA的特異性檢測，故檢出率較國外EBV DNA檢測陽性率低。

本實驗41例LN患兒腎臟組織免疫組化檢測結果顯示95.1%的患兒有LMP-1的表達，較Yu et al［12］報道的陽性率（58.6%）高，可能與本實驗均為LN兒童患者，兒童的EBV感染率較成人更高、更容易累及腎臟有關。

3種方法檢測LN患兒LMP-1的表達，腎臟組織免疫組化陽性率最高，較其它兩種方法有顯著性差異，提示EBV感染表達的LMP-1可能與兒童LN的腎臟病變有重要關系，腎臟組織免疫組化可能成為診斷EBV相關性LN的重要手段，而ELISA法及RT-PCR法檢測血液中LMP-1的表達可能成為預示LN的診斷方法。

參考文獻

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The expression of LMP-1 gene in juvenile lupus nephritis

Ding Yan1，2，Liao Wang1，Xiang Wei2，et al
（1Dept of Dermatology，Hainan General Hospital，Haikou 570102，2Dept of Dermatology，Maternal and Child Health Care Hospital of Hainan Province，Haikou 570206）

AbstractObjective To discuss the role of latent membrane protein 1（LMP-1）in the pathgenesis of juvenile lupus nephritis（LN）through investigating expression of LMP-1 by RT-PCR，immunohistochemistry and ELISA.

Methods RT-PCR，immunohistochemistry and ELISA were applied to detect expression of LMP-1 in PBMCs，kid-

ney tissue and serum from 20 patients with LN and 12 healthy control subjects respectively.Results ①There was signifcant difference between juvenile LN patients and healthy controls by RT-PCR，immunohistochemistry and ELISA，Positive rate were 65.9%vs 8.3%，95.1%vs 16.7%，22.0%vs 8.3%，respectively（P＜0.05）.②Positive rates of LMP-1 in juvenile LN were significantly different among three methods and the positive rate detected by immunohistochemistry was higher than the other two methods（P＜0.05）.Conclusion The results demonstrate that there are aberrant expression of LMP-1 gene in juvenile LN，thepositive rate of LMP-1 in kidney tissue is highest，suggesting that LMP-1 gene may contribute to the pathgenesis of juvenile LN.

Key wordsjuvenile；lupus nephritis；latent membrane protein 1；Epstein-Barr virus

作者簡介：丁 艷，女，博士研究生；何小解，男，副教授，碩士生導師，責任作者：E-mail：hexj7150＠163.com；向 偉，男，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：xiangwei8＠163.com

基金項目：海南省自然科學基金（編號：814314、309079）

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0676-04

中圖分類號R 373.9；R 758.69