Treg在慢性阻塞性肺疾病患者外周血及肺組織中的表達

章穎妹，嚴 青，劉 輝，石建邦，夏淮玲，徐曉玲

Treg在慢性阻塞性肺疾病患者外周血及肺組織中的表達

章穎妹，嚴 青，劉 輝，石建邦，夏淮玲，徐曉玲

摘要目的 觀察慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者外周血及肺組織中調節性T淋巴細胞（Treg）的表達并與肺功能正常者進行對照比較，探討Treg在COPD患者氣道炎癥中的作用以及吸煙對其表達的影響。方法 收集24例肺功能正常的不吸煙者（NS組）、22例肺功能正常的吸煙者（S組）、25例患有COPD的吸煙者（COPD組）為研究對象，分別采用流式細胞術、免疫組織化學染色法檢測3組研究對象外周血及肺組織中Treg表達。結果 COPD組的外周血中Treg表達均顯著高于S組及NS組，差異均有統計學意義（P＜0.01），S組的外周血Treg表達高于NS組，差異有統計學意義（P＜0.01）；COPD組的肺組織中Treg表達均顯著低于S組及NS組，差異均有統計學意義（P＜0.01），S組的肺組織中Treg表達水平低于NS組，差異無統計學意義；3組外周血Treg總表達與第1秒用力呼氣容積（FEV1）／預計值（%）負相關（P＜0.000 1），與吸煙量（年支）呈顯著正相關（P＜0.000 1），3組肺組織中Treg總表達與FEV1／預計值（%）無相關性（P＝0.338），與吸煙量（年支）呈顯著負相關（P＝0.031）。結論 COPD患者外周血中Treg表達上調，其肺組織中Treg表達下調。吸煙量與外周血中Treg表達呈正相關，與肺組織中Treg表達呈負相關。

關鍵詞T淋巴細胞；調節性；慢性阻塞性肺疾病；吸煙；氣道炎癥

2015-02-02接收

作者單位：安徽醫科大學附屬省立醫院呼吸內科，合肥 230001

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是氣道慢性炎癥性疾病，以不完全可逆、進行性發展的氣流受限為特征的疾病，發病機制未明確。目前主要認為吸煙為COPD主要危險因素，但是在所有吸煙者中只有近乎50%為COPD［1］。調節性T淋巴細胞（regulatory T lymphocytes，Treg）是一個CD4＋T細胞亞群，其主要功能為調節效應T淋巴細胞和維持自身免疫功能平衡［2］，叉頭狀轉錄因子（forkhead box P3，Foxp3）的表達可作為其標志分子。近年研究［3］提示Treg可能參與調節吸煙煙霧等有害氣體或顆粒誘導的氣道免疫炎癥反應。該研究旨在觀察COPD患者外周血及肺組織中Treg表達并與肺功能正常者進行對照比較，探討Treg在COPD患者氣道炎癥中的作用以及吸煙對其表達的影響。

1　材料與方法

1.1 病例資料 收集安徽醫科大學附屬省立醫院2012年1月～2013年12月胸外科行肺部切除手術的71例患者，男女不限，年齡＞35歲。根據患者的術前肺功能檢查結果以及患者吸煙史，分為肺功能正常不吸煙組（NS組，n＝24），肺功能正常吸煙組（S組，n＝22），患有COPD吸煙組（COPD組，n＝25）。COPD定義根據《慢性阻塞性肺疾病診治指南》（2007年修訂版）［4］診斷標準，吸入支氣管舒張劑后第一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，FEV1）／用力肺活量（forced vital capacity，FVC）＜70%；排除標準（滿足其中之一）：①患有風濕免疫系統疾病或者自身免疫缺陷者或過敏

性疾病如支氣管哮喘；②合并肺部及其他系統感染；③1個月內服用糖皮質激素；④術前已行放療或化療；⑤結合術后病理患有病毒性疾病或結核性疾病。

1.2 主要試劑和儀器 淋巴分離液（北京索來寶公司）；RMPI 1640培養液（美國Gibco公司）；抗人CD4-FITC單克隆抗體、抗人CD25-PE單克隆抗體、抗人Foxp3-PECy5單克隆抗體、固定破膜劑（美國eBioscience公司）；濃縮型鼠抗人Foxp3單克隆抗體（英國Abcam公司）；SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司）；肺功能儀（美國森迪斯公司）；高水平冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）；流式細胞儀（美國BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 流式細胞術檢測 抽取受試者清晨空腹靜脈血2 ml置于肝素抗凝管中，PBS與血液等比稀釋，平鋪于淋巴分離液之上，2 500 r／min離心30 min后提取白膜層至流式管中，加入PBS，2 000 r／min離心20 min，棄上清液。加RMPI培養液將細胞密度調整為2×106／ml，取100 μl至流式管，分別先后加入CD4-FITC、CD25-PE、破膜劑、Foxp3-PECy5，避光孵育、洗滌，棄上清液，上機檢測。分析軟件為Flow Jo 7.6，應用散點圖，設門，分析Treg占CD4＋T細胞百分比。

1.3.2 免疫組織化學染色檢測 選取安徽醫科大學附屬省立醫院胸外科符合入選標準患者的術后新鮮肺組織標本，常規行石蠟切片，厚約3 μm，首先行HE染色；然后免疫組化染色按試劑說明書行SP二步法染色。光鏡下計數和攝片。Foxp3的陽性信號主要定位于細胞核上呈棕黃色或者黃褐色顆粒狀。染色評估采用半定量積分法：光鏡下（400倍）觀察陽性細胞染色比例（0：＜5%；1：5%～25%；2：26% ～50%；3：51%～75%；4：＞76%）以及染色強度（0：基本不著色；1：淺黃色；2：棕黃色；3：棕褐色），將這兩項得分相乘得出最后的評分。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析，計量資料用±s表示，3組間的差異運用One-Way ANOVA檢驗；符合正態分布的數據的相關性分析采用Pearson相關，而不符合正態分布的數據的相關性分析采用Spearman秩相關。

2　結果

2.1 研究對象一般情況特點 與NS組及S組比較，COPD組FEV1／預計值（%）、FEV1／FVC（%）減低，差異有統計學意義（P＜0.01），S組FEV1／預計值（%）與NS組相比，差異無統計學意義，S組FEV1／FVC（%）與NS組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）；COPD組吸煙量（年支）與S組比較，差異無統計學意義；COPD組年齡與S組比較，差異無統計學意義，而NS組年齡與S組、COPD組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；此外，NS組中男女比例以女性為主，而S組與COPD組男性占絕大多數比例。見表1。

表1　各組研究對象一般資料（±s）

表1　各組研究對象一般資料（±s）

與NS組比較：**P＜0.01；與S組比較：＃＃P＜0.01

項目　NS組（n＝24）　S組（n＝22）　COPD組（n＝25）　F值年齡（歲）　48.17±15.398 59.32±10.987**63.88±9.034**10.844性別（男／女）　7／17　21／1　25／0吸煙量（年支）　0　834.09±571.420 864.00±538.424 28.277 FEV1／預計值（%）　94.87±14.032　90.64±9.781 65.24±17.025**＃＃31.619 FEV1／FVC（%）　84.39±4.851 76.27±4.108**59.88±8.303**＃＃101.993

2.2 外周血中Treg表達 3組間的外周血中Treg表達差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。COPD組外周血Treg表達顯著高于S組及NS組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；S組外周血Treg表達高于NS組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

2.3 肺組織中Treg表達 3組間的肺組織中Treg （Foxp3＋）表達差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。Treg在COPD組的肺組織中表達顯著低于S組及NS組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；S組的

肺組織中Treg表達低于NS組，但差異無統計學意義。見表2。2.4 相關性分析 ①3組資料匯總分析，外周血Treg總表達與FEV1／預計值（%）呈負相關（Pearson相關）（r＝-0.541，P＜0.000 1）；外周血Treg總表達與吸煙量（年支）呈正相關（Pearson相關）（r＝0.616，P＜0.000 1）。②3組資料匯總分析，肺組織Treg總表達與FEV1／預計值（%）之間無相關性（Spearman秩相關）（rs＝0.115，P＝0.338）；肺組織Treg總表達與吸煙量（年支）呈負相關（Spearman秩相關）（rs＝-0.256，P＝0.031）。

表2　各組的Treg在外周血、肺組織中的表達（±s）

表2　各組的Treg在外周血、肺組織中的表達（±s）

與NS組比較：**P＜0.01；與S組比較：＃＃P＜0.01

項目　NS組　S組　COPD組　F值外周血Treg（%）　2.14±0.82 3.97±1.13**　5.50±1.00**＃＃45.33肺組織Treg（分）　3.67±1.71 3.23±2.02　2.20±1.26**＃＃4.94

3　討論

目前認為COPD的主要病理特征為小氣道壁上多種炎癥細胞浸潤，以中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞為主，炎癥導致氣道壁的損失-修復過程反復發生，進而引起氣道結構重塑，導致COPD氣流受限的主要病理基礎之一。研究［5］不僅證實COPD小氣道壁上存在上述炎癥細胞浸潤，小氣道壁厚與FEV1／預計值（%）呈負相關，且發現COPD疾病進展與CD8＋T、B淋巴細胞數量呈正相關，提示COPD存在著獲得性免疫介導的氣道炎癥反應。而Treg通過產生和誘導各種細胞因子（如IL-10、TGF-β、IL-4、IFN-γ等）在COPD氣道炎癥中發揮著重要的抗炎作用。本研究結果顯示COPD組外周血中Treg表達比S組、NS組顯著升高，與Smyth et al［6］研究結果一致，而與Wang et al［7］研究結果不一致。目前認為COPD不僅僅表現為氣道和肺的異常炎癥反應，也有顯著的全身效應，如Gan et al［8］的薈萃分析發現，炎癥性細胞因子（包括TNF-α、IL-6、IL-8、IL-18、CRP等）濃度在COPD患者外周血中升高，并且隨著疾病進展更加顯著。本研究中COPD組及S組外周血中Treg高表達，與吸煙量呈正相關，可能與香煙煙霧直接與間接刺激下外周血中存在持續炎癥介質，Treg在外周血中發揮持續抗炎作用有關。

本研究結果顯示COPD組的肺組織中Treg表達比S組、NS組顯著減低；S組的肺組織中Treg表達比NS組稍減低，差異無統計學意義。與Isajevs et al［9］的研究結果一致，不同的是其研究結果顯示吸煙組的小氣道中Foxp3＋表達比不吸煙組升高。亦與Chu et al［10］的研究結果一致。此外，本研究中S組與COPD組的吸煙量（年支）比較，差異無統計學意義，然而相同吸煙強度暴露下，某些吸煙者能夠維持正常的肺功能，有些卻發展為COPD。Cosio et al［11］從分子免疫角度闡述COPD疾病進展與體內免疫調節機制（Treg與γδ CD8＋T細胞）功能損傷程度呈正相關。結合以上研究推測，肺功能正常吸煙者及COPD患者肺組織中Treg表達降低引起Treg免疫調節抑制、抗炎等功能受損，導致機體氣道炎癥、重塑等COPD病理改變而無法維持正常的肺功能及肺功能進一步下降。這些本研究中目前肺功能正常的吸煙者仍是罹患COPD高危人群。

綜上所述，本研究顯示COPD患者外周血中Treg表達上調，其肺組織中Treg表達下調；吸煙量與外周血中Treg表達呈正相關，與肺組織中Treg表達呈負相關。本研究反映Treg在COPD外周血與肺內表達不一致，為其在COPD外周及氣道炎癥中作用提供理論依據；Treg在肺功能正常吸煙者及不吸煙者外周血與肺內表達不同，也為香煙煙霧暴露人群易患COPD的發病機制的探討提供新的線索。［1］ Mannino D M，Buist A S.Global burden of COPD：risk factors，prevalence，and future trends［J］.Lancet，2007，370（9589）：765-73.

參考文獻

［2］ Jiang H，Chess L.An integrated view of suppressor T cell subsets in immunoregulation［J］.J Clin Invest，2004，114（9）：1198-208.

［3］ Brusselle G G，Joos G F，Bracke K R.New insights into the immunology of chronic obstructive pulmonary disease［J］.Lancet，2011，378（9795）：1015-26.

［4］ 中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組.慢性阻塞性肺疾病診治指南（2007年修訂版）［J］.中華結核和呼吸雜志，2007，30（1）：8-17.

［5］ Hogg J C，Chu F，Utokaparch S，et al.The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease［J］.N Engl J Med，2004，350（26）：2645-53.

［6］ Smyth L J，Starkey C，Vestbo J，et al.CD4-regulatory cells in COPD patients［J］.Chest，2007，132（1）：156-63.

［7］ Wang H，Peng W，Weng Y，et al.Imbalance of Th17／Treg cells in mice with chronic cigarette smoke exposure［J］.Int Immunopharmacol，2012，14（4）：504-12.

［8］ Gan W Q，Man S F，Senthilselvan A，et al.Association between chronic obstructive pulmonary disease and systemic inflammation：a systematic review and a meta-analysis［J］.Thorax，2004，59 （7）：574-80.

［9］ Isajevs S，Taivans I，Strazda G，et al.Decreased FOXP3 expression in small airways of smokers with COPD［J］.Eur Respir J，2009，33（1）：61-7.

［10］Chu S，Zhong X，Zhang J，et al.The expression of Foxp3 and ROR gamma t in lung tissues from normal smokers and chronic obstructive pulmonary disease patients［J］.Int Immunopharmacol，2011，11（11）：1780-8.

［11］Cosio M G，Saetta M，Agusti A.Immunologic aspects of chronic obstructive pulmonary disease［J］.N Engl J Med，2009，360 （23）：2445-54.

The expression of Treg in peripheral blood and lung tissue of COPD

Zhang Yingmei，Yan Qing，Liu Hui，et al
（Dept of Respiratory Medicine，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

AbstractObjective To observe the expression of regulatory T lymphocytes（Treg）in peripheral blood and lung tissue of patients with chronic obstructive pulmonary disease（COPD）and investigate the role of Treg in the airway inflammation of COPD and how smoking impacts the expression of Treg compared with population of normal lung function.Methods A total of 24 subjects were nonsmokers with normal lung function（NS group），22 subjects were smokers with normal lung function（S group）and 25 subjects were smokers with COPD（COPD group）.The percentage of Treg in peripheral blood was measured by flow cytometry，and the immune-histochemical methods were used to evaluate Treg expression in lung tissue.Results The percentage of Treg in peripheral blood significantly increased in COPD group compared with S group and NS group，the difference was statistically significant（P ＜0.01）；the percentage of Treg in peripheral blood significantly increased in S group compared with NS group，the difference was statistically significant（P＜0.01）；the Treg levels in lung tissue were significantly decreased in COPD group between S group and NS group，the difference was statistically significant（P＜0.01）.The Treg levels in lung tissue were significantly decreased in S group between NS group，the difference was not statistically significant.The total percentage of Treg in peripheral blood with FEV1%pred was a negative correlation（P＜0.000 1），and there was a positive correlation with smoking index（P＜0.000 1）；there was no significant correlation between Treg levels in total of lung tissue with FEV1%pred（P＝0.338），but with smoking index there was a negative correlation（P＝0.031）.Conclusion In COPD patients，the percentage of Treg in peripheral blood is up-regulated，but Treg levels in lung tissue are down-regulated.There is a positive correlation between smoking index and the percentage of Treg，but it is negatively correlated with Treg levels in lung tissue.

Key wordsT lymphocytes；regulatory；chronic obstructive pulmonary disease；smoking；airway inflammation

作者簡介：章穎妹，女，碩士研究生；徐曉玲，女，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：xxlahh08＠163.com

基金項目：安徽省自然科學基金（編號：1208085MH158）

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0679-04

中圖分類號R 563.3