SIRT1在骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中表達(dá)的相關(guān)研究

丁 輝，胡 勇，常 俊，張琪琪，闕玉康，許唐兵，魏 偉

SIRT1在骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中表達(dá)的相關(guān)研究

丁 輝1，胡 勇1，常 俊2，張琪琪1，闕玉康1，許唐兵1，魏 偉3

摘要目的 探討沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）在骨性關(guān)節(jié)炎（OA）正常滑膜組織及細(xì)胞中表達(dá)的差異性。方法 膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞培養(yǎng)傳代，甲苯胺藍(lán)染色觀察細(xì)胞形態(tài)，Western blot法檢測滑膜組織及細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)情況；免疫組織化學(xué)法對滑膜細(xì)胞檢測SIRT1表達(dá)情況及表達(dá)部位。結(jié)果 甲苯胺藍(lán)實(shí)驗(yàn)顯示OA及正常滑膜細(xì)胞無明顯形態(tài)學(xué)差異；免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示SIRT1在滑膜細(xì)胞胞質(zhì)中廣泛表達(dá)，染色強(qiáng)度OA組較正常組明顯降低（t＝20.208，P＜0.01）；Western blot法顯示在滑膜細(xì)胞中OA組SIRT1表達(dá)明顯低于正常對照組（（t＝8.619，P＜0.01）；在滑膜組織中OA組SIRT1的表達(dá)亦明顯低于正常對照組（t＝7.664，P ＜0.01）。結(jié)論 SIRT1與OA導(dǎo)致滑膜炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為SIRT1可以作為OA治療的靶點(diǎn)提供一個(gè)新的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞骨關(guān)節(jié)炎；滑膜組織；滑膜細(xì)胞；SIRT1

2015-01-13接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)與骨腫瘤科，合肥230022

2安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院骨科，合肥 2300323安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，合肥 230032

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是發(fā)病最高的關(guān)節(jié)疾病之一，尤其以膝關(guān)節(jié)為主，其病理特征主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的退行性病變，但絕不僅僅局限于軟骨，關(guān)節(jié)的其他組成部分包括軟骨下骨、滑膜、半月板和韌帶共同參與其病理改變［1］，各部分相互影響作用加速了關(guān)節(jié)的退變。多種信號傳導(dǎo)通路參與OA發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，其中核因子-kB（nuclear factorkB，NF-κB）途徑發(fā)揮著重要作用［2］。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（Sirtuin type 1，SIRT1）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）依賴的組蛋白脫乙酰酶，作為Sirtuins家族成員之一，SIRT1被認(rèn)為與細(xì)胞的增殖、分化、衰老以及凋亡密切相關(guān)［3］。有研究［4］顯示其可抑制NF-κB途徑的上游靶點(diǎn)從而抑制下游多種促炎因子。該研究旨在探討SIRT1在兩者中的表達(dá)差異性，為進(jìn)一步研究提供參考資料。

1　材料與方法

1.1 病例資料 收集2013年1月～2014年6月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科二病區(qū)的住院患者。①OA組：因膝骨性關(guān)節(jié)炎行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中所取標(biāo)本共20例，男10例，女10例，年齡62～78歲，中位年齡72.3歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)2001年推薦OA診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；②正常對照組：因急性外傷致下肢截肢術(shù)或因脛骨平臺(tái)骨折行開放復(fù)位內(nèi)固定術(shù)中所取標(biāo)本10例，男6例，女4例，年齡19～42歲，中位年齡34.2歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理學(xué)診斷關(guān)節(jié)無病變。標(biāo)本離體后無菌狀態(tài)下放置于裝有生理鹽水的無菌標(biāo)本盒中，2 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2 試劑與儀器 Elivision免疫組化兩步法檢測試劑盒（福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；Motic BA600 Mot-7.5型自動(dòng)顯微鏡（廈門Motic公司）；RIPA組織裂解液和SDS-PAGE加樣緩沖液（北京碧云天生物技術(shù)研究所）；兔抗Anti-SIRT1單克隆抗體（英國Abcam公司）；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；ECL顯影液（美國Thermo公司）。

1.3 滑膜細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 無菌條件下將標(biāo)本剪成約1～2 mm3小塊，用含青霉素和鏈霉素雙抗的PBS漂洗3遍，分離并棄除混雜其中的脂肪組織。將提純過的滑膜組織一部分轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中均勻平鋪，加入1.5 ml含20%胎牛血清的DMEM，置于二氧化碳培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中，每2～3 d換培養(yǎng)液，1周后培養(yǎng)瓶中貼壁細(xì)胞即為原代滑膜細(xì)胞。細(xì)胞接近匯合時(shí)胰酶消化，1∶2傳代培養(yǎng)，傳至第3代使用。

1.4 甲苯胺藍(lán)染色法觀察細(xì)胞形態(tài)及免疫組織化學(xué)檢測滑膜細(xì)胞SIRT1表達(dá)及分布特點(diǎn)

1.4.1 甲苯胺藍(lán)染色及免疫組化 滑膜細(xì)胞接種至已放入無菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，置于二氧化碳培養(yǎng)箱過夜，棄培養(yǎng)基，干燥。甲苯胺藍(lán)染色步驟為：0.1%甲苯胺藍(lán)液浸染10 min，PBS漂洗3遍，各級

乙醇溶液脫水，二甲苯透明，封片，鏡下觀察；免疫組化步驟為：4%多聚甲醛固定30 min，滴加0.5% Triton X-100通透30 min，3%內(nèi)源性過氧化物阻滯劑H2O2一抗（稀釋濃度1∶250）4℃冰箱過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，各級乙醇溶液脫水，二甲苯透明，封片，鏡下觀察。

1.4.2 甲苯胺藍(lán)染色及免疫組化結(jié)果判斷 均采用Motic BA600MOT-7.5型自動(dòng)顯微鏡對各組結(jié)果掃描拍照，甲苯胺藍(lán)染色每張圖片選取5個(gè)隨機(jī)視野（×400），胞質(zhì)呈淡藍(lán)色作為陽性標(biāo)記；免疫組化使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對各組圖片結(jié)果進(jìn)行積分光密度檢測分析，每張圖片選取5個(gè)隨機(jī)視野（×400），選取胞質(zhì)呈棕黃色細(xì)胞作為陽性結(jié)果標(biāo)記，以此為參照自動(dòng)掃描所有視野的陽性結(jié)果，再從選定圖片中隨機(jī)選取視野（×1 000）重復(fù)對照。以參數(shù)平均積分光密度代表蛋白顆粒密度。

1.5 Western blot法檢測滑膜組織及細(xì)胞中SIRT1表達(dá) 提取組織蛋白時(shí)，冰浴條件下0.05 g滑膜組織加入499 μl RIPA組織裂解液和1 μl苯甲磺酰氟中研磨裂解30 min，裂解液移至1.5 ml EP管中；提取細(xì)胞蛋白時(shí)，棄培養(yǎng)基后每瓶細(xì)胞加入297 μl RIPA組織裂解液和3 ul苯甲磺酰氟冰上裂解30 min，刮棒刮取細(xì)胞后將細(xì)胞及裂解液移至1.5 ml EP管中。將EP管14 000 r／min離心15 min后取上清液，按4∶1加入SDS上樣緩沖液，煮沸15 min，冷卻后用10%SDS-PAGE凝膠電泳2 h，電轉(zhuǎn)使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶37℃封閉2 h，加入兔抗SIRT1一抗（1∶5 000）及鼠抗β-actin一抗（1∶500）4℃孵育過夜，山羊抗兔標(biāo)記二抗（1 ∶30 000）、山羊抗鼠標(biāo)記二抗（1∶30 000）常溫孵育2 h，TBS漂洗3遍及PBS漂洗1遍后加ECL液顯影，掃描儀中成像。Image J軟件進(jìn)行分析各組條帶計(jì)算灰度值。以β-actin蛋白灰度值作為內(nèi)參，二者比值即為灰度值比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)分析結(jié)果用柱狀圖表示，采用t檢驗(yàn)比較組間差異。

2　結(jié)果

2.1 甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果 滑膜細(xì)胞大部分呈梭形，兩極胞突細(xì)長，末端多與臨近細(xì)胞相連，交織成網(wǎng)狀，網(wǎng)間可見少部分小星型或多邊形細(xì)胞。正常組與OA組滑膜細(xì)胞無明顯形態(tài)學(xué)差異，見圖1、2。

2.2 免疫組化法檢測結(jié)果 在正常組及OA組滑膜細(xì)胞中，胞質(zhì)廣泛呈棕黃色，細(xì)胞核及細(xì)胞膜未見明顯黃染，OA組染色強(qiáng)度較正常組明顯降低，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝20.208，P＜0.01），見圖3。

2.3 Western blot法檢測結(jié)果 OA患者滑膜組織及細(xì)胞中SIRT1表達(dá)低于正常組，正常組與OA組灰度值經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。部分滑膜組織正常組及OA組顯影結(jié)果及柱狀圖見圖4（t＝7.664，P＜0.01），滑膜細(xì)胞正常組及OA組顯影結(jié)果及柱狀圖見圖5（t＝8.619，P＜0.01）。

3　討論

以往認(rèn)為OA的主要特征是關(guān)節(jié)軟骨變性，并在軟骨下方及關(guān)節(jié)周圍有新骨形成。隨著對OA研究的不斷深入，滑膜病變對OA病程的影響開始越來越受到重視，現(xiàn)已通過基因芯片法證實(shí)滑膜對OA病程的發(fā)展起到關(guān)鍵性作用［6］。細(xì)胞凋亡是OA發(fā)生發(fā)展過程中不可忽視的一個(gè)重要因素［7］。軟骨凋亡退變導(dǎo)致基質(zhì)破壞，釋放的降解片段被滑膜細(xì)胞中巨噬樣細(xì)胞吞噬，引起滑膜發(fā)生炎癥反應(yīng)，而炎癥滑膜細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）等炎

性介質(zhì)及膠原酶等蛋白水解酶［8-9］。其中IL-1β可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶基因mRNA表達(dá)，增強(qiáng)軟骨基質(zhì)破壞降解，還可誘導(dǎo)產(chǎn)生一氧化氮，抑制蛋白聚糖及Ⅱ型膠原合成，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡；IL-6不僅通過自分泌形式影響軟骨和滑膜細(xì)胞的正常增殖，還可協(xié)同IL-1阻礙成纖維細(xì)胞膠原合成，抑制軟骨細(xì)胞的合成修復(fù)；TNF-α通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶活性抑制軟骨基質(zhì)中糖蛋白和膠原合成，加速軟骨基質(zhì)分解，是軟骨基質(zhì)降解的重要介質(zhì)［10-12］；膠原酶則直接破壞溶解軟骨基質(zhì)導(dǎo)致其分解。上述機(jī)制形成軟骨—滑膜的惡性循環(huán)，加速OA病情的發(fā)展。

SIRT1在人體中絕大部分細(xì)胞中都有表達(dá)，近年來成為腫瘤、衰老、炎癥及心血管系統(tǒng)等研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。其中，SIRT1使促凋亡因子P53蛋白第373、320以及382位賴氨酸殘基去乙酰化，抑制P53與靶DNA順式元件結(jié)合，抑制P53促凋亡活性，從而抑制細(xì)胞凋亡［13］。同時(shí)Yeung et al［14］指出，SIRT1是NF-κB的p65亞單位的直接靶點(diǎn)，通過抑制p65亞單位的Lys310位點(diǎn)，不影響其他賴氨酸位點(diǎn)，使其發(fā)生去乙酰化，降低NF-κB蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制對下游基因的轉(zhuǎn)錄功能，進(jìn)一步抑制其對下游因子包括IL-1、TNF-α、IL-8、IL-6等炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄水平，改善炎癥癥狀。而滑膜炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平的降低不僅改善滑膜炎的自身癥狀，同時(shí)打破軟骨—滑膜的惡性循環(huán)過程，減少軟骨細(xì)胞的凋亡及基質(zhì)的破壞降解，使之成為良性循環(huán)，延緩OA病

情的發(fā)展。

以往的OA研究重點(diǎn)集中于軟骨組織及細(xì)胞，有研究［15］證實(shí)OA軟骨細(xì)胞與正常軟骨細(xì)胞對比SIRT1表達(dá)量明顯減少，而細(xì)胞凋亡率顯著增加。本研究顯示，在OA引起的滑膜炎組織及細(xì)胞中，SIRT1表達(dá)量與正常滑膜組織對比顯著降低，且SIRT1廣泛平均分布于滑膜細(xì)胞胞質(zhì)中，細(xì)胞核及細(xì)胞膜未見明顯表達(dá)，而炎癥介質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中被轉(zhuǎn)錄表達(dá)，由此推斷SIRT1在細(xì)胞質(zhì)中抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，改善自身的炎癥狀況，減少炎癥介質(zhì)在關(guān)節(jié)液中含量，延緩軟骨細(xì)胞的凋亡及基質(zhì)的破壞分解。其表達(dá)量減少對IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)抑制降低，通過特異性增加SIRT1可能有效的控制OA病情的發(fā)展。

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◇經(jīng)驗(yàn)與體會(huì)◇

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The research of SIRT1 expression in osteoarthritis synovial membrane

Ding Hui1，Hu Yong1，Chang Jun2，et al
（1Dept of Joint and Bone Tumors，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Orthopedics，The Fourth Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230032）

AbstractObjective To investigate the expression of silent information regulator factor 2 related enzyme 1 （SIRT1）in osteoarthritis（OA）synovial membrane tissue and cells.Methods Knee joint synovial membrane cells were cultured，and the synovial membrane cells morphology was detected by toluidine blue staining.The expression of SIRT1 protein in osteoarthritis synovial membrane tissue and cells was detected by Western blot.The expression and distribution of SIRT1 protein was also detected by immunohistochemistry.Results Toluidine blue assay showed that OA and normal synovial cells had no obvious morphological difference；Immunohistochemistry showed that SIRT1 was widely expressed in synovial cells，the staining intensity of OA group was significantly decreased compared with normal group（t＝20.208，P＜0.01）；Western blot showed that the expression of SIRT1 in synovial cells in OA group was significantly lower than that in normal control group（t＝8.619，P＜0.01）；The expression of SIRT1 in synovium of OA group was obviously lower than that in the normal group（t＝7.664，P＜0.01）.Conclusion The low expression of SIRT1 may play an essential role in OA progression，and the research provides a new theoretical basis for SIRT1 as therapeutic target in OA treatment.

Key wordsosteoarthritis；synovial tissues；synovial cells；SIRT1

作者簡介：丁 輝，男，碩士研究生；胡 勇，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：hy.in163＠163.com；魏 偉，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wwei＠ahmu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：81173075）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0691-04

中圖分類號R 684.3