多沙唑嗪和美托洛爾對腹主動脈縮窄致高血壓大鼠血管重塑的影響

黃立雙, 劉偉麗, 弓景波, 杲修杰, 趙 云, 馬 婧, 謝 方, 張 濤,田凱琦, 姚 林, 錢令嘉

(1. 河北聯合大學公共衛生學院, 河北 唐山 063000; 2. 軍事醫學科學院基礎醫學研究所, 北京 100850;3. 軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所, 天津 300050)

多沙唑嗪和美托洛爾對腹主動脈縮窄致高血壓大鼠血管重塑的影響

黃立雙1,2, 劉偉麗3, 弓景波2, 杲修杰3, 趙 云2, 馬 婧2, 謝 方2, 張 濤2,田凱琦1, 姚 林1, 錢令嘉2

(1. 河北聯合大學公共衛生學院, 河北 唐山 063000; 2. 軍事醫學科學院基礎醫學研究所, 北京 100850;3. 軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所, 天津 300050)

目的 觀察多沙唑嗪及美托洛爾對腹主動脈縮窄(AAC)誘導的大鼠血管重塑的影響。方法采用AAC法成功建立血管重塑大鼠模型。2周后每天ig給予多沙唑嗪10 mg·kg-1或美托洛爾20 mg·kg-1，連續6周。采用頸總動脈插管測量大鼠的平均動脈壓；采用HE染色和圖像分析儀檢測大鼠主動脈中膜厚度、中膜面積和中膜厚度與管腔內徑比值；Masson染色檢測纖維化；Western蛋白印跡法檢測膠原蛋白和纖連蛋白表達。結果 與假手術組血壓(17.6±0.5)kPa相比，模型組大鼠血壓(23.3±0.7) kPa顯著升高(P<0.05)，給予多沙唑嗪〔(20.5±0.7)kPa〕或美托洛爾〔(19.0±0.4) kPa〕均可有效降低血壓(P<0.05)。HE染色結合圖像分析儀分析發現，模型組大鼠血管中膜厚度、中膜面積及中膜厚度與血管內徑比值較假手術組分別升高39.5%, 46.4%和27.0%(P<0.05)，給予多沙唑嗪或美托洛爾使血管的中膜厚度分別下降16.0%和26.1%(P<0.05), 中膜面積分別下降22.8%和29.1%(P<0.05), 中膜厚度與血管內徑比值分別下降17.0%和26.0%(P<0.05)。Masson染色結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠血管組織膠原蛋白的沉積增多，血管出現纖維化；而給予多沙唑嗪或美托洛爾可以緩解高血壓誘導的纖維化發生。Western蛋白印跡結果顯示，模型組大鼠血管組織中膠原蛋白和纖連蛋白的表達明顯增加(P<0.05)，而多沙唑嗪組和美托洛爾組較模型組膠原蛋白和纖連蛋白表達顯著下降(P<0.05)。結論 多沙唑嗪和美托洛爾可能通過抑制去甲腎上腺素與其特異性受體結合，從而選擇性地阻斷去甲腎上腺素對血管的誘導作用，逆轉高血壓誘導的血管重塑的發生。

血管重塑; 高血壓; 多沙唑嗪; 美托洛爾

血管重塑是引起高血壓等血管疾病和循環功能紊亂的病理基礎，高血壓血管重塑最典型的特征表現為中膜增厚、腔內徑縮小和細胞外基質增多等，目前對于逆轉高血壓血管重塑的研究主要集中在腎素血管緊張素系統。但當機體長期處于壓力超負荷狀態下，交感神經興奮性增加，釋放兒茶酚胺類物質(腎上腺素和去甲腎上腺素)。去甲腎上腺素作為交感神經分泌的主要神經遞質之一，與分布在血管上的腎上腺素能受體結合，具有強烈的縮血管和升壓作用[1-2]。研究發現，去甲腎上腺素在高血壓和動脈粥樣硬化等心血管疾病發生發展過程中起重要作用[3-5]，其可通過促進血管平滑肌細胞的表型轉化、增殖、遷移和細胞外基質蛋白的沉積，參與血管重塑的發生發展[6-8]。α-和β-腎上腺素受體阻滯劑作為降壓藥已經廣泛應用于臨床，但其對于高血壓誘導的血管重塑的影響卻未見報道。多沙唑嗪(doxazosin, DOX)為選擇性α1-腎上腺素受體阻滯劑，既可以明顯降低血壓，同時也克服了非選擇性α-腎上腺素受體阻滯劑導致的心率加快的副作用。美托洛爾(metoprolol, MET)為選擇性β1-腎上腺素受體阻滯劑，其在降壓的同時也克服了非選擇性β-腎上腺素受體阻滯劑對血管和支氣管平滑肌的收縮作用。由于高血壓用藥原則指出一般先采取單一降壓藥物服用一個時期，降壓效果不佳時，再選擇聯合用藥，因此，本研究主要分別觀察DOX和MET單一對高血壓血管重塑的影響，旨在探討選擇性阻斷去甲腎上腺素與特異性受體結合對高血壓誘導血管重塑的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器DOX(美國輝瑞制藥公司)，MET(英國阿斯利康制藥有限公司)，纖連蛋白單克隆抗體(美國Santa公司)，膠原Ⅰ+Ⅲ型抗體(英國Abcam公司)，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG抗體和山羊抗兔IgG抗體(中衫金橋生物技術有限公司)，辣根過氧化物標記GAPDH抗體(上海康成生物有限公司)，苯甲基磺酰氟 (PMSF, 美國Sigma公司)，RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(海門碧云天生物技術研究所)，Masson 染色試劑盒(雷根生物有限技術公司)，其他均為國產分析試劑。生理記錄儀(MP150，美國Biopac公司)，多功能酶標儀(Varioskan, 美國Thermo Scientific公司)，電泳元件及附件(美國Bio-Rad公司)，玻璃勻漿器(軍事醫學科學院)，分析天平(BP221S型, 美國Sartorius公司)，熒光倒置顯微鏡(TH4-200, 日本Olympus公司)，臺式冷凍離心機(TLL-C, 四環科學儀器有限公司)。

1.2 動物、模型制備和分組48只Wistar雄性大鼠，體質量180～200 g，由軍事醫學科學院動物實驗中心提供，〔SCXK-(軍)2012-0002〕。按照文獻[9]的方法，通過腹主動脈縮窄制備高血壓大鼠模型。術后給予大鼠1%氯化鈉鹽水，單籠飼養。術后2周，大鼠隨機分假手術組(只穿線不結扎)、模型組、DOX組(ig給予DOX 10 mg·kg-1)和MET組(ig給予MET 20 mg·kg-1)。假手術組與模型組分別給予等量的生理鹽水。連續6周。

1.3 血壓的測定2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后分離并夾閉左側頸總動脈，用眼科剪在左側頸總動脈上剪一個小孔，將充滿1%肝素鈉的聚乙烯管插入頸總動脈并用手術線將其固定好后，松開動脈夾，用MP150多導生理記錄儀讀取大鼠的平均動脈壓。

1.4 HE染色檢測胸主動脈的病理變化實驗結束后，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠。迅速分離出胸主動脈置于4%的多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋切片，將組織切片進行HE染色，采用圖像分析儀檢測血管中膜厚度、中膜面積和中膜厚度與管腔內徑比值。

1.5 Masson染色檢測血管纖維化按1.4分離主動脈血管組織，切片，脫蠟至水。按照Masson試劑盒中提供的實驗步驟進行染色。藍色為膠原蛋白，紅色為彈力纖維等。

1.6 Western蛋白印跡法檢測膠原蛋白和纖連蛋白表達采用玻璃勻漿的方法提取大鼠血管組織蛋白。按照每60 mg組織0.3 mL裂解液將其加入勻漿器中(裂解液中加入1%的磷酸化抑制劑NaF、Na3VO4和1%蛋白酶抑制劑PMSF)，置于冰浴中進行充分研磨，之后置于4℃生化培養箱內裂解1 h，然后5000×g離心15 min。采用BCA蛋白定量方法對組織蛋白進行定量，Western蛋白印跡法檢測組織中膠原蛋白和纖連蛋白的表達。以目標蛋白與內標條帶的積分吸光度比值表示蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1 多沙唑嗪和美托洛爾對腹主動脈縮窄大鼠血壓的影響表1結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠血壓明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，DOX和MET組血壓均顯著下降(P<0.05)，表明DOX 與MET 均可明顯緩解腹主動脈縮窄導致的血壓升高。

Tab.1 Effect of doxazosin(DOX) and metoprolol(MET) on arterial blood pressure of AAC rats

GroupArterialbloodpressure/kPaSham17．6±0．5Model23．3±0．7?Model+DOX20．5±0．7#Model+MET19．0±0．4#

2.2 多沙唑嗪和美托洛爾對腹主動脈縮窄大鼠血管病理改變的影響HE染色(圖1)及圖像分析儀定量結果(表2)顯示，與假手術組相比，模型大鼠血管中膜厚度、中膜面積和中膜厚度與管腔內徑比值均顯著性升高(P<0.05)，同時伴隨平滑肌細胞的增加、遷移和彈性纖維斷裂(圖1)。與模型組相比，DOX和MET組顯著改善(P<0.05)，同時伴隨彈性纖維斷裂的減少。表明高血壓可以誘導血管重塑的發生，而DOX和MET可以明顯改善高血壓誘導的血管重塑。

Fig.1 Effect of DOX and MET on morphological change of vassels of AAC rats (HE staining). See Tab.1 for the rat treament. A1 and B1: sham; A2 and B2: model; A3 and B3: model+DOX; A4 and B4: model+MET.

Tab.2 Effect of DOX and MET on tunica media thickness, artery vessel area and thickness/inner diameter of AAC rats

GroupTunicamediathickness/μmArteryvesselarea/mm2Thickness∶innerdiameterSham118±130．53±0．030．073±0．008Model164±16?0．79±0．05?0．100±0．010?Model+DOX138±11#0．61±0．04#0．083±0．008#Model+MET121±11#0．56±0．03#0．074±0．006#

2.3 多沙唑嗪和美托洛爾對腹主動脈縮窄大鼠細胞外基質蛋白沉積的影響Masson染色結果顯示(圖2)，與假手術組相比，模型組大鼠血管膠原蛋白沉積增加，血管出現纖維化(圖2B)；DOX和MET組血管纖維情況化較模型組改善(圖2C,D)。

Western蛋白印跡結果(圖3)顯示，與假手術組相比，模型組大鼠血管組織纖連蛋白、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達明顯增加(P<0.05)；給予DOX及MET后，纖連蛋白和膠原蛋白表達明顯減少(P<0.05)，表明DOX與MET均可明顯緩解高血壓誘導的血管纖維化的發生。

Fig.2 Effect of DOX and MET on extracellular matrix accumulation in vassels of AAC rats (Masson staining). See Tab.1 for the treament. A: sham; B: model; C: model+DOX; D: model+MET. Blue color indicates collagen. Arrows show vasular fibrilation.

3 討論

本研究發現，α1受體阻滯劑DOX和β1受體阻滯劑MET在降低血壓的同時，均使大鼠主動脈厚度、中膜面積和中膜厚度與管腔內徑比值下降。表明這兩種腎上腺素受體阻滯劑均具有減輕高血壓誘導的血管重塑的作用。此外，本研究還發現，高血壓誘導的血管組織中膠原的沉積明顯減少，膠原蛋白和纖連蛋白表達受到抑制。這一結果提示，DOX和MET可能是通過阻斷與其受體結合，抑制細胞外基質蛋 白 的 表 達，降低血管纖維化的發生，進而發揮作用。α1-和β1-腎上腺素受體阻滯劑降壓的作用機制并不相同，α1受體阻滯劑主要通過舒張血管降低血壓，而β1受體阻滯劑主要是通過降低心率，減少心輸出量，抑制腎素血管緊張素的釋放及調節中樞神經系統的β受體發揮降壓的作用[10-11]。兩者可能通過降低血壓減輕壓力超負荷對血管平滑肌機械作用，從而發揮減輕血管重塑的作用。另一方面，去甲腎上腺素與α和β受體結合可以活化蛋白激酶C信號通路。研究表明，蛋白激酶C的活化可以明顯誘導血管平滑肌細胞的活化進而分泌細胞外基質蛋白，從而參與血管重塑的發生[12-16]。而本研究中，DOX組和MET組膠原蛋白和纖連蛋白顯著下降，提示α1和β1受體阻滯劑可能是通過活化蛋白激酶C通路引起細胞外基質蛋白表達下降，進而發揮作用。此外，腎素血管緊張素系統活化可以明顯促進血管平滑肌細胞分泌細胞外基質蛋白誘導血管重塑的發生。有研究發現，β1腎上腺素受體阻滯劑對腎素血管緊張素系統具有重要的調節作用，提示β1腎上腺素受體阻滯劑也可能通過抑制腎素血管緊張素系統從而發揮其抗血管重塑的作用[17]。本研究中MET抑制細胞外基質蛋白表達的效果明顯優于DOX，此結果與這一結論相符。對于α1-和β1-腎上腺素受體阻滯劑對抗高血壓誘導的血管重塑的機制仍需進一步探討。綜上所述，DOX和MET不僅具有降壓作用，而且其可選擇性地阻斷去甲腎上腺素與其受體結合，抑制血管平滑肌細胞表型轉換、遷移、增殖和細胞外基質蛋白的沉積，從而發揮保護血管的作用。

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(本文編輯: 喬 虹)

Effect of doxazosin and metoprolol on vascular remodeling in ratswith hypertension induced by abdominal aorta coarctation

HUANG Li-shuang1,2, LIU Wei-li3, GONG Jing-bo2, GAO Xiu-jie3, ZHAO Yun2, MA Jing2, XIE Fang2,ZHANG Tao2, TIAN Kai-qi1, YAO Lin1, QIAN Ling-jia2

(1.SchoolofPublicHealth,HebeiUniversity,Tangshan063000,China; 2.InstituteofBasicMedicalSicences,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China;3.InstituteofHygieneandEnvironmentalMedicine,AcademyofMilitaryMedicaiSciences,Tianjin300050,China)

OBJECTIVE To investigate the effect of doxazosin(DOX) and metoprolol(MET) on vascular remodeling in rats with abdominal aorta coarctation (AAC). METHODS An animal model was established by AAC. Two weeks later, the rats were treated with DOX (10 mg·kg-1per day) or MET (20 mg·kg-1per day) for six weeks. Blood pressure was measured using carotid artery intubation with a MP150 polygraph. The media thickness, wall cross-sectional area and thickness/internal diameter ratio were calculated by morphometry. Vascular fibrosis was evaluated by Masson′s trichrome staining. The collagen and fibronectin expression in vascules was measured by Western blotting. RESULTSCompared with the sham group 〔(17.6±0.5)kPa〕, the mean arterial blood pressure in the model group 〔(23.3±0.7)kPa〕 was significantly increased(P<0.05), but was lowered by DOX 〔(20.5±0.7)kPa〕 and MET 〔(19.0±0.4)kPa〕(P<0.05). Moreover, HE staining showed that tunica media thickness, artery vessel area and thickness/inner diameter in the model group were increased by 39.5%, 46.4% and 27.0%(P<0.05), respectively. The tunica media thickness was decreased by 16.0% and 26.1%(P<0.05), respectively, the artery vessel area by 22.8% and 26.1%(P<0.05), respectively, and the thickness/inner diameter by 17.0% and 26.0%(P<0.05) when the rats were treated with DOX and MET. Masson staining showed that the collagen accumulation in vascules increased, suggesting that AAC induced fibrosis. Meanwhile, vascular fibrosis induced by AAC was also reduced by MET or DOX. Western blotting also proved that the increase of collagen and fibronectin induced by AAC could be attenuated by DOX and MET(P<0.05). CONCLUSION DOX and MET are effective in suppressing the role of norepinephrine in vassels, which can attenuate AAC-induced vassels remodeling by preventing the binding between norepinephrine and adrenoceptors.Key words: vascular remodeling; hypertension; doxazosin; metroprolol

YAO Lin, E-mail: yaolin766@163.com; QIAN Ling-jia, E-mail: newjia@vip.sina.com

國家重點基礎研究發展規劃(2011CB505106); 天津市自然科學重點基金(10JCZDJC19300)

黃立雙，女，碩士研究生，主要從事藥物毒理學研究，E-mail: xiaoqiaoliushui64@163.com; 姚 林，男，碩士生導師，主要從事藥物毒理學研究; 錢令嘉，女，研究員, 博士生導師，主要從事應激醫學研究。

姚 林，E-mail: yaolin766@163.com；錢令嘉, E-mail:newjia@vip.sina.com

Foundation item: The project supported by National Program on Key Basic Research Project of China(2011CB505106); and Tianjin Municipal Natural Science Fund(10JCZD19300)

2014-11-28 接受日期: 2015-03-20)

R972

A

1000-3002(2015)02-0208-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.004

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