6′-羥基爵床素A誘導人肝癌HepG2細胞凋亡及其機制

宋維才, 賀曉麗, 路 暢, 李鳳金, 童元峰, 肖洪彬, 畢明剛

(1. 黑龍江中醫藥大學基礎醫學院, 黑龍江 哈爾濱 150040; 2. 中國醫學科學院藥用植物研究所,北京 100193; 3. 中國醫學科學院藥物研究所, 北京 100050)

6′-羥基爵床素A誘導人肝癌HepG2細胞凋亡及其機制

宋維才1, 賀曉麗2, 路 暢2, 李鳳金1, 童元峰3, 肖洪彬1, 畢明剛2

(1. 黑龍江中醫藥大學基礎醫學院, 黑龍江 哈爾濱 150040; 2. 中國醫學科學院藥用植物研究所,北京 100193; 3. 中國醫學科學院藥物研究所, 北京 100050)

目的 探討6′-羥基爵床素A(JR6)對人肝癌HepG2細胞凋亡的誘導作用及其機制。方法 體外培養人肝癌HepG2細胞，采用MTT法觀察不同濃度的JR6和5-氟尿嘧啶(5-FU)對HepG2細胞存活的作用，熒光顯微鏡觀察Hoechst33258染色后細胞核形態改變，用流式細胞儀檢測AnnexinⅤ-FITC/PI雙染后HepG2細胞的凋亡率，JC-1熒光染色觀察藥物對細胞線粒體膜電位的影響，Western蛋白質印跡法檢測細胞凋亡相關蛋白細胞色素c、Bax和Bcl-2蛋白的表達。結果 JR6 6.1～196 μmol·L-1和5-FU 3.4～192 μmol·L-1分別作用HepG2細胞48 h，對HepG2細胞存活具有抑制作用，IC50分別為74.90和49.75 μmol·L-1。 JR6 12.3, 49和196 μmol·L-1作用HepG2細胞48 h，細胞凋亡率明顯增加，由正常對照組的(6.9 ±2.0)% 增加至(13.8±2.0)%，(18.6±4.3)%和(32.4 ±3.2)%(P<0.05,P<0.01)。Hoechst33258染色結果顯示，JR6 49和196 μmol·L-1作用HepG2細胞48 h，部分細胞出現細胞核固縮和染色質凝集等凋亡變化。線粒體膜電位檢測結果發現，JR6 49和196 μmol·L-1作用48 h能使HepG2細胞線粒體膜電位水平明顯降低(P<0.05,P<0.01)。線粒體凋亡相關蛋白的檢測結果表明，JR6 12.3, 49和196 μmol·L-1作用HepG2細胞48 h，胞漿細胞色素c表達增加，促凋亡蛋白Bax表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，且Bax/Bcl-2比值增加(P<0.05,P<0.01)。JR6 49 μmol·L-1和5-FU組上述蛋白表達無明顯差異。結論 JR6可能通過促進細胞色素c釋放、打破Bcl-2/Bax平衡誘導HepG2細胞凋亡。

6′-羥基爵床素A; HepG2細胞; 細胞凋亡; 線粒體

天然產物是抗腫瘤藥物研究的重要來源。從天然產物尋找毒性作用小、作用獨特的抗腫瘤藥物及抗腫瘤輔助藥物已成為國內外醫藥學家關注的熱點。鬼臼毒素具有較強的抗腫瘤和抗病毒的作用，但由于其毒性大，從而限制了其在臨床上應用。后期人們以其基本結構為母核，發現了一些低毒性、高活性的抗腫瘤藥物，如依托泊苷和替尼泊苷等[1-2]。通過對鬼臼毒素衍生物結構改造和構效關系的研究，尋找新的高活性化合物依然是抗腫瘤藥物的研究熱點。爵床為主產于我國西南部和南部各省及臺灣等地的爵床科植物爵床(JusticiaprocumbensL.)的干燥全草，收載于《中國藥典》，具有清熱解毒、利尿消腫等功效[3]。本課題組通過活性追蹤----MTT體外篩選方法對爵床的不同部位進行初篩，發現乙酸乙酯部位為抗腫瘤活性有效部位，從中分離得到3個新化合物和4個已知化合物[4-5]。活性初篩結果顯示，新化合物6′-羥基爵床素A(6′-hydroxy justicidin A, JR6)對EJ和HepG2等多種腫瘤細胞增殖的抑制作用更為明顯，經結構鑒定，其母核與鬼臼毒素的母核類似。前期研究發現，JR6能夠干預EJ細胞內的氧化還原系統平衡，升高活性氧水平，從而抑制EJ細胞的增殖[4]。本研究將探討JR6對人肝癌HepG2細胞凋亡的作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、細胞、試劑和儀器JR6由中國醫學科學院藥物研究所化學合成室合成，純度為95.34%，用二甲亞砜(DMSO)將藥物溶解，-20℃分裝保存，實驗時用完全培養基稀釋成所需濃度(DMSO終體積分數不超過0.001)。人肝癌HepG2細胞購自中國醫學科學院腫瘤醫院。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)購自天津金耀藥業有限公司；DMEM培養基、胎牛血清和胰蛋白酶均購于美國Gibco公司；青霉素和鏈霉素混合液購自北京Biotopped公司；四甲基偶氮唑鹽和Hoechst33258購自美國Sigma公司；AnnexinⅤ-FITC/PI雙染試劑盒和JC-1試劑盒購于美國BD公司；Western蛋白免疫印跡試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；兔抗人Bax和細胞色素c多抗購于武漢博士德生物工程有限公司；Bcl-2和β肌動蛋白一抗及二抗購于北京天德悅生物科技有限責任公司；其余試劑均為國產分析純。CO2恒溫培養箱和低溫高速離心機，美國Thermo公司；多管架自動平衡離心機，湘儀離心機儀器有限公司；熒光倒置顯微鏡，日本Olympus公司；流式細胞儀，美國BD公司；電泳儀、電轉儀和凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司；酶標儀，美國BIOTEK公司；高內涵成像系統，美國Molecular Devices公司。

1.2 人肝癌HepG2細胞培養人肝癌HepG2細胞為貼壁細胞，用DMEM培養基(含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素100 kU·L-1)置于5%CO2，37℃恒溫培養箱中常規培養。待細胞生長到80%左右時消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 MTT法檢測細胞存活收集處于對數生長期的HepG2細胞，調整細胞密度為3.5×107 L-1，以每孔100 μL的細胞懸液接種到96孔板，培養24 h待細胞貼壁后棄去培養上清液，加入含不同濃度藥物的培養液，使JR6終濃度為6.1，12.3，24.5，49，98和196 μmol·L-1，陽性對照5-FU終濃度為3.4，7.69，17.2，38.4，85.9和192 μmol·L-1，每孔200 μL，每組設3個復孔，各藥物作用組為實驗組。對照組為含有與實驗組等量細胞的200 μL細胞懸液，并設調零孔(空白培養基，不加細胞)。細胞培養48 h后，每孔加入20 μL的MTT (5 g·L-1)。放入孵箱繼續培養4 h，吸棄孔內液體，并加入DMSO 150 μL溶解反應產物，振蕩混勻10 min后，使用酶標儀在570 nm波長處檢測各孔的吸光度(A570 nm)值，計算細胞存活抑制率。細胞存活抑制率(%)=〔1-(實驗組A570 nm-空白組A570 nm)/(對照組A570 nm-空白組A570 nm)〕×100%。

1.4 Hoechst33258染色法檢測細胞凋亡取對數生長期細胞，以每孔3×105細胞密度接種到6孔板，分別設置對照組和藥物組，每組3復孔。培養24 h后吸棄培養基，PBS洗2次，分別加入含JR6(終濃度為12.3，49和196 μmol·L-1)或5-FU(終濃度為38.4 μmol·L-1)的培養液處理48 h。PBS漂洗1次，每孔加入4%多聚甲醛1 mL固定10 min。去除固定液，PBS漂洗2次，加入2 mL濃度為 10 mg·L-1的Hoechst33258稀釋液，避光靜置30 min。棄去染色液，PBS漂洗2次。熒光倒置顯微鏡下隨機選取3個視野，觀察細胞核染色并拍照。

1.5 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡率取對數生長期細胞，以每孔3×105細胞密度接種到6孔板，分別設置對照組和藥物組，每組3復孔。按1.4加藥處理48 h后，按照AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書，將消化后的細胞重懸于100 μL含AnnexinⅤ-FITC和PI各5 μL的緩沖液中，避光孵育15 min后，再向每管加入400 μL緩沖液，立即進行流式細胞凋亡的檢測。流式細胞儀采用激發波長488 nm，發射波長為530 nm檢測FITC熒光，另一波長>575 nm檢測PI。正常的活細胞不被AnnexinⅤ-FITC和PI染色；早期凋亡細胞僅被AnnexinⅤ-FITC染色，PI染色呈陰性；晚期凋亡細胞和壞死細胞可以同時被AnnexinⅤ-FITC和PI雙重染色。

1.6 線粒體膜電位的檢測取對數生長期細胞，以每孔3×105細胞密度接種到6孔板，分別設置對照組和藥物組，每組3復孔。按1.4加藥處理48 h后，① 每孔加入1 mL 濃度為10 mg·L-1的JC-1稀釋液，孵箱內避光染色15 min后，用PBS洗2～3次，加入無血清DMEM培養基1 mL，用高內涵成像系統觀察不同藥物濃度條件下，線粒體熒光強度的變化，并拍照記錄。② 收集細胞于5 mL流式管中，根據JC-1膜電位檢測試劑盒說明書，用DMSO 125 μL將JC-1溶解，1×Assay Buffer 100倍稀釋成工作液，每管加500 μL工作液，放入37℃孵箱中避光孵育 15 min，離心，棄上清，先后用1×Assay Buffer 2 mL, 1mL各洗1次后用再用0.5 mL液體重懸，用流式細胞儀檢測HepG2細胞內線粒體膜電位的變化。

1.7 Western蛋白質印跡法檢測細胞色素c、Bcl-2和Bax蛋白表達 取對數生長期細胞，以每孔9×105細胞密度接種于100 mm培養皿中，培養24 h，加入上述濃度JR6與5-FU誘導48 h，收集細胞，加入含PMSF的裂解液裂解30 min，提取各組細胞總蛋白；通過Dounce勻漿器研磨各組細胞，分步離心提取線粒體及胞漿蛋白[6]，BCA法測定蛋白質含量。進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質，將蛋白轉移到NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，按說明書稀釋細胞色素c、Bcl-2和Bax相應一抗，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，按說明稀釋二抗，搖床上室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。用ECL化學發光顯色液避光孵育5 min，于凝膠成像儀中曝光。用目的蛋白條帶積分吸光度/對應內參條帶積分光密度的比值表示待測蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1 JR6對HepG2細胞存活的抑制作用MTT實驗結果顯示，不同濃度JR6和5-FU與HepG2細胞分別作用48 h后，對細胞存活具有明顯的抑制作用(圖1)。JR6和5-FU的IC50分別為74.90和49.75 μmol·L-1。

Fig.1 Effect of 6′-hydroxy justicidin A (JR6) on survival of HepG2 cells. HepG2 cells were cultured with different concentrations of JR6 or 5-fluorouracil(5-FU)for 48 h.

Fig.2 Effect of JR6 on apoptosis of HepG2 cells by Hoechst33258 assay(×200). See Fig.1 for the cell treatment. A: normal control; B-D: JR6 12.3, 49 and 196 μmol·L-1group, respectively; E: 5-FU 38.4 μmol·L-1group. Arrows show pathologic changes in apoptosis.

用AnnexinⅤ-FITC和PI染色后，用流式細胞儀檢測結果(圖3)顯示，JR6作用于HepG2細胞48 h后，HepG2細胞凋亡率明顯增加，其中早期凋亡細胞較少，以晚期凋亡細胞和壞死細胞為主。與對照組相比，JR6組和陽性藥5-FU組細胞均出現明顯凋亡，且隨JR6濃度的增加，細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。

2.3 JR6對HepG2細胞線粒體膜電位的影響高內涵熒光成像系統結果顯示，正常對照組細胞膜電位最高，呈現紅色熒光；JR6組與5-FU組細胞紅光減弱，綠光增強，且隨著JR6濃度的增加，紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸加強(圖4)。流式細胞儀檢測結果(圖5)與高內涵熒光成像結果相一致。與正常對照組相比，JR6 49和196 μmol·L-1組和5-FU組細胞線粒體膜電位下降的比例增加(P<0.05, P<0.01)，且隨著JR6濃度的增加，對應綠色熒光強度的細胞群比例增加，對應紅色熒光強度的細胞群有所減少。

2.4 JR6對HepG2細胞線粒體凋亡相關蛋白表達的影響JR6和5-FU分別作用于HepG2細胞48 h后，與細胞對照組相比，胞漿細胞色素c表達明顯增加(P<0.01)，且隨著JR6濃度的增加，細胞色素c表達逐漸增多(圖6)。與細胞對照組相比，JR6和5-FU分別作用于HepG2細胞48 h，促凋亡蛋白Bax表達增加，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達降低，Bax/Bcl-2比值明顯增加(P<0.05, P<0.01)；表明在JR6誘導HepG2細胞凋亡的過程中，細胞色素c釋放增加，Bcl-2/Bax平衡被打破。

3 討論

JR6是本課題組從爵床中分離得到的全新單體化合物。我們前期對多種腫瘤細胞進行了體外篩選實驗，JR6均表現出不同程度的細胞增殖抑制作用。本研究在前期研究的基礎上，進一步探討JR6對人肝癌HepG2細胞增殖的影響及其誘導細胞發生凋亡的作用。研究結果表明，JR6對HepG2細胞作用48 h顯著抑制了細胞存活，IC50為74.90 μmol·L-1，說明JR6對HepG2細胞具有明顯的細胞毒作用。5-FU是多種消化系統癌，如肝癌和胃癌的有效抗腫瘤藥物，影響腫瘤細胞增殖[7]。因此，本研究選用5-FU作為JR6的陽性對照藥，其IC50為49.75 μmol·L-1，與JR6相差不大。

Hoechst33258為非嵌入性熒光染料，活細胞或固定細胞均可從低濃度溶液中攝取該染料，從而使細胞核著色，故又把此類染料稱為DNA探針；在熒光顯微鏡紫外線激發時，正常細胞染色質分布均勻，核被染成均勻藍色，核濃縮并呈明亮藍白色為凋亡細胞；核染色實驗發現其出現上述表現，且JR6 49和196 μmol·L-1組有凋亡小體出現。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測結果與其一致，也證實隨著JR6藥物濃度的增加，HepG2細胞的凋亡率逐漸增高。由此提示，JR6可誘導HepG2細胞發生凋亡。細胞凋亡機制研究的重要進展之一就是對線粒體在凋亡過程中的認識，線粒體調控特定的凋亡通路，線粒體的功能完整是細胞存活的重要前提。線粒體膜電位反映線粒體的功能狀態。大量實驗證實，線粒體在凋亡信號的誘導下，跨膜電位下降，膜通透轉變孔道開放，從而使細胞產生凋亡[8-9]。在細胞發生凋亡前期，均能觀察到線粒體跨膜電位的下降，且跨膜電位的下降將導致細胞凋亡的發生，提示跨膜電位的下降是凋亡的一個早期特征[10]。JR6處理后的HepG2細胞中，其線粒體膜電位明顯降低，說明JR6可以通過影響線粒體的功能而影響細胞生理活性。目前為止，大多數抗腫瘤的藥物都可在不同類型的腫瘤細胞中誘導凋亡[11]。因此推測，JR6可能通過使HepG2細胞線粒體膜電位去極化而激活線粒體介導的細胞凋亡途徑。本研究主要從JR6對線粒體介導HepG2細胞凋亡的“內源性通路”進行探究。Bcl-2蛋白家族對線粒體通透性有調節且對細胞凋亡起到關鍵的作用，其家族成員目前發現有20多個，主要分為2類：促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。促凋亡蛋白主要有Bax，Bak及Bid等，抗凋亡蛋白主要有Bcl-2和Bcl-XL等[12]，其相互之間的作用也非常復雜。促凋亡蛋白功能增強或抗凋亡蛋白功能降低(其二者比值也增加)導致線粒體膜通透性增加，引起細胞色素c從線粒體釋放進入胞漿，與Apaf-1和胱天蛋白酶原9形成復合物，激活胱天蛋白酶途徑，從而活化下游胱天蛋白酶3，最終導致細胞發生凋亡[13-14]。本研究結果顯示，JR6使Bax表達增加而使Bcl-2表達降低，胞漿細胞色素c表達明顯增加，說明JR6可能促進細胞色素c釋放，打破Bcl-2/Bax平衡，從而誘導HepG2細胞發生凋亡。綜上所述，JR6能顯著抑制HepG2細胞的增殖，誘導其凋亡，其誘導HepG2細胞發生凋亡的機制可能是通過促進細胞色素c釋放、打破Bcl-2/Bax平衡發揮的。但關于JR6與5-FU藥效及作用機制的差異，以及JR6抗腫瘤作用的具體作用位點和其他作用機制，還有待更全面和深入的研究。

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(本文編輯: 齊春會)

Effect of 6′- hydroxy justicidin A on apoptosis and its mechanismin human hepatocelluar carcinoma HepG2 cells

SONG Wei-cai1, HE Xiao-li2, LU Chang2, LI Feng-jin1, TONG Yuan-feng3, XIAO Hong-bin1, BI Ming-gang2

(1.CollegeofBasicMedicine,HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China；2.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100193,China; 3.InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

OBJECTIVE To investigate the effect of 6′-hydroxy justicidin A (JR6) on apoptosis and its mechanism in hepatocellular carcinoma HepG2 cells. METHODS HepG2 cells were cultured with JR6 or 5-fluorouracil(5-FU) at different concentrations for 48 h. The proliferation of HepG2 cells was tested by MTT assay. Hoechst33258 staining was employed to observe nucleus morphological changes. The apoptotic ratio and mitochondrial membrane potential were measured by AnnexinⅤ-FITC/PI double staining and JC-1 staining, respectively. The protein expression of cytochrome c, Bax and Bcl-2 proteins was evaluated by Western blotting. RESULTS After HepG2 cells were treated with different concentrations of JR6 6.1-196 μmol·L-1and 5-FU 3.4-192 μmol·L-1for 48 h, cell proliferation was significantly inhibited, while the IC50value was 74.90 and 49.75 μmol·L-1，respectively. JR6 12.3, 49 and 196 μmol·L-1treatment for 48 h could induce apoptosis in HepG2 cells, the apoptosis rate of cells increased from (6.9±2.0)% to (13.8±2.0)%，(18.6±4.3)% and (32.4 ±3.2)% (P<0.05,P<0.01). Hoechst33258 staining indicated cell shrinkage and nuclear condensation in HepG2 cells treated with JR6 49 and 196 μmol·L-1for 48 h. JR6 49 and 196 μmol·L-1treatment for 48 h significantly decreased the mitochondrial membrane potential (P<0.05,P<0.01). Western boltting results showed that after JR6 12.3, 49 and 196 μmol·L-1treatment for 48 h, the expression of cytochrome c increased in cytosolic fraction, the expression of Bax increased while that of Bcl-2 decreased, leading to an increase in the Bax/Bcl-2 ratio(P<0.05,P<0.01). There was no significant difference between JR6 49 μmol·L-1group and 5-FU group. CONCLUSIONJR6 can significantly induce apoptosis in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells, mainly by promoting cytochrome c release and breaking the balance of Bcl-2/Bax.Key words: 6′-hydroxy justicidin A; HepG2 cells; apoptosis; mitochondria

BI Ming-gang, Tel: (010)57833233, E-mail: mgbi@implad.ac.cn

北京市自然科學基金(7142113)；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金(yz-13-09)

宋維才(1990-),男,碩士研究生,主要從事抗腫瘤藥理學研究；畢明剛(1970-), 男, 博士, 研究員, 主要從事神經藥理和抗腫瘤藥理學研究。

畢明剛, E-mail: mgbi@implad.ac.cn, Tel: (010)57833233

Foundation item: The project supported by Beijing Natural Science Foundation (7142113); and Fundamental Research Funds for Central Scientific Research Institutions for Public Welfare (yz-13-09)

2014-12-31 接受日期: 2015-03-23)

R979.1,R285.5

A

1000-3002(2015)02-0220-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.006

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