低濃度p, p′-滴滴涕對大腸腺癌SW620細胞增殖和凋亡的影響

劉建新, 趙君宇, 晉小婷, 李卓玉, 宋 莉,2

(1. 山西大學生物技術研究所化學生物學與分子工程教育部重點實驗室, 山西 太原 030006;2. 浙江大學環境與資源學院, 浙江 杭州 310058)

低濃度p, p′-滴滴涕對大腸腺癌SW620細胞增殖和凋亡的影響

劉建新1, 趙君宇1, 晉小婷1, 李卓玉1, 宋 莉1,2

(1. 山西大學生物技術研究所化學生物學與分子工程教育部重點實驗室, 山西 太原 030006;2. 浙江大學環境與資源學院, 浙江 杭州 310058)

目的 探討低濃度p,p′-滴滴涕暴露對大腸癌SW620細胞增殖和凋亡的影響及作用機制。方法用p,p′-滴滴涕1×10-12～1×10-6mol·L-1作用于SW620細胞48和96 h后, 采用MTT實驗檢測細胞存活率。用p,p′-滴滴涕1×10-10, 1×10-9和1×10-8mol·L-1處理SW620細胞96 h后，用流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡率。Western蛋白質印跡法檢測Wnt/β-連環蛋白信號通路成員β-連環蛋白、磷酸化β連環蛋白和磷酸化糖原合成酶激酶3β，下游靶蛋白c-Myc 和細胞周期蛋白D1，以及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶原8和胱天蛋白酶原3表達水平。結果p,p′-滴滴涕1×10-12～1×10-7mol·L-1作用96 h，明顯促進SW620細胞存活(P<0.01)；p,p′-滴滴涕1×10-10, 1×10-9和1×10-8mol·L-1處理SW620細胞96 h, 與對照組相比，G1期細胞百分率顯著減少(P<0.01)，S期細胞百分率顯著增加(P<0.01)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)；Wnt/β-連環蛋白信號通路成員β-連環蛋白和磷酸化糖原合成酶激酶3β以及下游靶蛋白c-Myc和細胞周期蛋白D1水平顯著升高(P<0.01)，磷酸化β連環蛋白水平顯著降低(P<0.01)；凋亡相關蛋白Bcl-2、胱天蛋白酶原8和胱天蛋白酶原3表達顯著升高(P<0.01)，Bax表達和胱天蛋白酶3活性顯著降低(P<0.01)。結論 低濃度p,p′-滴滴涕可能通過激活Wnt/β-連環蛋白信號通路及影響凋亡相關蛋白表達,進而促進SW620細胞增殖，抑制 SW620細胞凋亡。

滴滴涕; 大腸癌; Wnt信號通路; β-連環蛋白; Bcl-2; 胱天蛋白酶3

滴滴涕(dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT)是一種人工合成的有機氯農藥。由于其化學性質穩定，難降解，殘留時間長，且可通過食物鏈蓄積放大，對人類生命健康造成了嚴重威脅。研究發現，DDT具有生殖發育毒性、免疫毒性、神經毒性、干擾內分泌功能和致癌性[1-5]。近年來，DDT的致癌作用已受到廣泛關注。DDT 暴露與多種腫瘤發生密切相關，如乳腺癌、肝癌和胰腺癌等[1-5]。大腸癌是常見的惡性腫瘤，其發生與高脂肪低纖維飲食和遺傳因素等有關[6-8]。此外，攝入食物的化學污染也被考慮作為大腸癌發病的一個重要因素[9]。流行病學調查顯示，DDT 暴露與大腸癌的發病有關[10-12]。目前關于DDT暴露與大腸癌發病的相關性只限于流行病學研究，對于DDT暴露促進大腸癌發病的分子機制未見報道。研究發現，異常的Wnt/β-連環蛋白信號通路在大腸癌發生和發展中發揮著重要的作用[13-14]；同時也有研究表明，在癌癥的發生和進展中，細胞凋亡機制的異常具有重要的作用[15-17]。因此，本研究以DDT暴露于大腸癌SW620細胞，檢測其對大腸癌SW620細胞增殖和凋亡的影響,并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物、主要試劑和儀器人大腸癌細胞SW620購自中國科學院上海分院細胞研究所。p,p′-DDT購自美國Sigma公司。DMEM培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物公司；胰蛋白酶購自中國Solarbio公司；β-連環蛋白抗體購自美國Abmart公司；磷酸化糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase, GSK)3β抗體購自美國Cell Signaling公司；硫酸化β連環蛋白抗體購自英國BBI公司；c-Myc、細胞周期蛋白D1、胱天蛋白酶原8和胱天蛋白酶原3抗體購自美國Bioword公司；α-微管蛋白抗體購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(H+L)和羊抗兔IgG(H+L)二抗購自美國Invitrogen公司；胱天蛋白酶3試劑盒購自碧云天生物技術研究所；細胞周期和凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。CO2細胞恒溫培養箱，美國Thermo Forma公司；全自動酶標儀、蛋白質電泳儀和電轉儀，美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養和藥物配制人大腸癌細胞SW620生長在含有10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素100 kU·L-1的DMEM培養基中，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養。采用胰酶消化細胞并傳代。取對數生長期細胞進行實驗。將p,p′-DDT溶于DMSO配成100 mmol·L-1母液。使用時用DMEM培養基稀釋至1×10-12～1×10-6 mol·L-1的實驗濃度，對照組DMSO濃度為0.1%。

1.3 MTT法檢測細胞存活取對數生長期細胞，0.05%胰酶消化，DMEM培養基調整細胞濃度，按1×104 L-1的細胞密度接種于96孔板，每孔加入100 μL，置于37℃，5%的CO2培養箱中貼壁培養24 h后，棄去培養基。實驗組用含p,p-DDT 1×10-12～1×10-6 mol·L-1的DMEM培養基孵育, 對照組用含0.1%DMSO的DMEM培養基孵育。處理48和96 h后，每孔分別加入20 μL MTT溶液, 繼續置于37℃培養箱孵育4 h。小心吸出孔內培養上清液，每孔分別加入100 μL DMSO置于搖床上振蕩10 min，于酶標儀570 nm波長下測定吸光(A)值，每組設5個平行孔。

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡取對數生長期細胞，按照每孔2×105個細胞接種于6孔培養板，培養24 h后棄上清，加入p,p′- DDT 1×10-10, 1×10-9和1×10-8 mol·L-1培養96 h后，胰酶消化，PBS洗滌細胞2次，1000×g離心5 min，棄上清; 70%乙醇4℃固定過夜，PI避光染色30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期, 每組設3個平行。同時取上述p,p′- DDT暴露后的細胞，按試劑盒說明書分別加入Annexin-FITC和PI，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 Western蛋白質印跡法檢測Wnt/β-連環蛋白信號通路相關蛋白表達取對數生長期細胞，0.05%胰酶消化，DMEM培養基調整細胞濃度，按1×106細胞接種于60 mm培養皿中，置于37℃，5%的CO2培養箱中貼壁培養24 h后，棄去培養基，用含p,p′-DDT 1×10-10, 1×10-9和1×10-8 mol·L-1的DMEM培養基孵育。每48 h換一次培養基，孵育96 h后，加入細胞裂解液裂解10 min，13 000×g離心10 min，收集上清蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。將樣品與5×SDS蛋白上樣緩沖液以4∶1比例混勻，沸水浴5 min使蛋白變性，每孔80 μg蛋白，于12%SDS-PAGE凝膠電泳分離。電轉移蛋白至NC膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入β-連環蛋白抗體(1∶1000)，磷酸化GSK3β抗體(1∶1000)，磷酸化β-連環蛋白抗體(1∶500)，c-Myc抗體(1∶500)，細胞周期蛋白D1抗體 (1∶500)，胱天蛋白酶原8抗體(1∶1000)，胱天蛋白酶原3抗體(1∶1000)和α-微管蛋白抗體(1∶1000) 4℃過夜孵育，然后分別加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1000)，室溫孵育1 h，TBS緩沖液洗膜3次，每次10 min。最后化學發光液顯像。實驗重復3次。

1.6 熒光分光光度法檢測胱天蛋白酶3活性取對數生長期細胞，0.05%胰酶消化，DMEM培養基調整細胞濃度，按1×106細胞接種細胞于60 mm培養皿中，貼壁培養24 h后，棄去培養基，用含p,p′-DDT 1×10-10，1×10-9和1×10-8 mol·L-1的DMEM培養基孵育。每48 h換一次培養基，孵育96 h后，按照半胱氨酸蛋白酶3活性檢測試劑盒說明書裂解細胞，Bradford法測定蛋白質濃度(c)。反應體系中加入10 μL裂解物、80 μL檢測緩沖液和10 μL 底物Ac-DEVD-pNA，于37℃孵育60 min，然后于酶標儀405 nm波長下測定A值，實驗重復3次。一個酶活力單位(U)定義為當底物飽和時，在37℃, 1 h內可以剪切1 nmol Ac-DEVD-pNA產生1 nmol pNA的胱天蛋白酶3的酶量。計算胱天蛋白酶3活性(kU·g-1蛋白)=U/c。

2 結果

2.1 不同濃度p,p′-DDT對大腸癌SW620細胞存活的影響如圖1所示，與細胞對照組相比，SW620細胞經p,p′-DDT 1×10-12～1×10-6 mol·L-1處理48 h后，細胞存活無明顯變化。p,p′-DDT 1×10-12～1×10-7 mol·L-1作用96 h后，隨著p,p′-DDT濃度的升高，細胞存活率明顯升高(P<0.01)；在p,p′-DDT 1×10-9 mol·L-1作用下， SW620細胞存活率最高；當p,p′-DDT濃度達到1×10-6 mol·L-1時，SW620細胞存活與對照組相比無明顯變化。以上結果表明，p,p′-DDT在低濃度(1×10-12～1×10-7 mol·L-1)作用SW620細胞96 h后，明顯促進SW620細胞存活。

2.2 p, p′-DDT對大腸癌SW620細胞周期的影響如圖2和表1 所示，與正常對照組相比較，p,p′-DDT 1×10-10, 1×10-9和1×10-8 mol·L-1處理SW620細胞96 h后，G1期細胞百分率明顯減少(P<0.01), 同時S期細胞百分率顯著增加(P<0.01)，表明p,p′-DDT可促使SW620細胞由G1期向S期過渡。

Fig.2 Effect of p,p′-DDT exposure for 96 h on SW620 cell cycle detected by flow cytometry. A: control group; B,C and D:p,p′-DDT 1×10-10, 1×10-9and 1×10-8mol·L-1group, respectively.

Tab.1 Effect of p,p′-DDT exposure for 96 h on SW620 cell cycle

p，p′?DDT/mol·L-1G1/%G2+M/%S/%0 53．7±1．615．33±0．3131．0±1．21×10-1050．1±0．4??11．57±0．15??38．4±0．3??1×10-944．0±0．7??10．52±0．86??45．4±1．4??1×10-845．8±0．5??11．53±0．40??42．6±0．8??

2.3 p,p′-DDT對大腸癌SW620細胞凋亡的影響如圖3所示，p,p′-DDT 1×10-10, 1×10-9和1×10-8 mol·L-1處理SW620細胞96 h后,與細胞對照組相比，細胞凋亡率明顯減少(P<0.01)。

2.4 p,p′-DDT暴露對Wnt/β-連環蛋白信號通路及下游靶蛋白c-Myc和細胞周期蛋白D1的影響由圖4可知，p,p′-DDT 1×10-10，1×10-9和1×10-8 mol·L-1處理大腸癌SW620細胞96 h后，與細胞對照組比較，β-連環蛋白和磷酸化GSK3β顯著升高(P<0.01)，β-連環蛋白分別為細胞對照組的1.67，3.45和2.76倍，磷酸化GSK3β分別為細胞對照組的1.92，2.28和1.57倍；磷酸化β-連環蛋白水平顯著降低(P<0.01)，分別為細胞對照組的82%，57%和60%。此外，Wnt/β-連環蛋白信號通路下游靶蛋白c-Myc和細胞周期蛋白D1的表達水平也顯著升高(P<0.01)，c-Myc分別為細胞對照組的2.08，3.00和2.23倍，細胞周期蛋白D1分別為對照組的3.80，4.23和3.95倍。

2.5 p,p′-DDT暴露對Bcl-2和Bax表達的影響由圖5可知，p,p′-DDT 1×10-10，1×10-9和1×10-8 mol·L-1處理大腸癌SW620細胞96 h 后，Bcl-2表達與細胞對照組相比顯著升高(P<0.01)，分別為細胞對照組的1.91，1.90和2.31倍；Bax表達顯著降低(P<0.01)，分別為細胞對照組的68%，49%和62%；Bcl-2/Bax比值明顯升高(P<0.01)，分別為細胞對照組的2.81，4.03和3.95倍。

2.6 p,p′-DDT暴露對胱天蛋白酶原3、胱天蛋白酶原8和胱天蛋白酶3活性的影響由圖6可知，SW620細胞經p,p′-DDT 1×10-10，1×10-9和1×10-8 mol·L-1處理96 h后，與對照組相比，胱天蛋白酶原3和胱天蛋白酶原8表達明顯升高(P<0.05)。胱天蛋白酶原3分別為細胞對照組的2.06，2.32和1.97倍，胱天蛋白酶原8分別為對照組的2.47，2.67和3.65倍。由圖7可知，SW620細胞經p,p′-DDT 1×10-10，1×10-9和1×10-8 mol·L-1處理96 h后，與對照組相比，胱天蛋白酶3活性明顯降低，分別為對照組的74%，56%和80%。

3 討論

本研究發現，p,p′-DDT 1×10-12～1×10-7mol·L-1暴露96 h明顯促進SW620細胞的存活，表明低濃度p,p′-DDT可能通過促進大腸癌細胞的存活影響大腸癌的進展。異常的Wnt/β-連環蛋白信號通路在大腸癌發生和發展中發揮著重要的作用[13-14]。正常的細胞中沒有Wnt信號，胞漿內的β-連環蛋白大部分與細胞膜上的鈣黏蛋白結合，少部分游離的β-連環蛋白與一個由GSK3β、結腸腺瘤息肉蛋白和軸蛋白所形成的復合物結合，GSK3β磷酸化β-連環蛋白氨基端保守的絲氨酸/蘇氨酸，促使β-連環蛋白的降解[18]。GSK3β是一種絲/蘇氨酸磷酸激酶，其氨基端的第9位的絲氨酸磷酸化后可顯著抑制其活性[19]。在大腸癌中，Wnt/β-連環蛋白信號通路異常激活是由通路中各成分包括GSK3β、結腸腺瘤息肉蛋白和β-連環蛋白突變所致，導致β-連環蛋白在細胞質內積累并轉移至細胞核內，并與細胞核內轉錄因子TCF/LEF相結合，啟動下游靶基因c-Myc和細胞周期蛋白D1等的轉錄激活，進而導致細胞異常增殖[20-21]。本研究發現，p,p′-DDT處理SW620 細胞后，β-連環蛋白和磷酸化GSK3β上調，磷酸化-β-連環蛋白水平顯著降低。此外，Wnt/β-連環蛋白信號通路下游靶蛋白c-Myc和細胞周期蛋白D1的表達水平也顯著升高。本研究發現，p,p′-DDT處理SW620細胞后，細胞周期發生改變，G1期細胞百分率減少，S期細胞百分率增多。文獻報道，c-Myc和細胞周期蛋白D1是調節G1/S期過渡的關鍵蛋白[22]。上述結果表明，p,p′-DDT暴露可能通過抑制GSK3β的活性進而導致β-連環蛋白的穩定性提高，進一步上調Wnt/β-連環蛋白信號通路的下游靶蛋白c-Myc和細胞周期蛋白D1表達，最終促進大腸癌SW620 細胞的存活。細胞凋亡的發生與多種凋亡相關基因有關，如Bcl-2和胱天蛋白酶家族等。Bcl-2蛋白家族按功能可分為2類，一類具有抗凋亡作用，包括Bcl-2和Bcl-xl等；另一類為促凋亡成員，包括Bax和Bak等[23]。胱天蛋白酶家族是在細胞凋亡過程中起關鍵作用的酶，在細胞凋亡網絡中居中心地位。研究發現，在癌癥的發生和進展中，細胞凋亡機制的異常具有重要的作用[15-17]。Wright等[17]研究發現，一些致癌或促癌劑像DDT和PMA等通過抑制凋亡進而促進腫瘤的進展。Burow等[24]發現，DDT處理乳腺癌MCF-7細胞后拮抗腫瘤壞死因子α誘導的細胞凋亡。此外，Kazantseva等[25]研究發現，DDT能調節小鼠肝細胞細胞周期并且同時抑制細胞凋亡，這一機制可能在DDT促進肝癌進展中起重要作用。本研究結果發現，p,p′-DDT處理SW620 細胞96 h后，細胞凋亡率降低，Bcl-2表達明顯上調，而Bax表達明顯下調， Bcl-2/Bax比值明顯升高；胱天蛋白酶原8和胱天蛋白酶原3的水平顯著升高，并且胱天蛋白酶3活性明顯降低，表明DDT干擾了胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶3的活化。以上結果表明，DDT可能通過影響凋亡相關蛋白進而抑制細胞凋亡。綜上所述，本研究結果表明，低濃度p,p′-DDT暴露可增加SW620細胞存活，促進細胞周期從G1期到S期進展，抑制細胞凋亡，進一步激活 Wnt/β-連環蛋白信號通路，并且影響凋亡相關蛋白的表達和活性，這可能與DDT促進大腸癌的發展有關。

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(本文編輯: 齊春會)

Effect of low concentrations of p,p′- dichlorodiphenyltrichloroethaneon proliferation and apoptosis of colorectaladenocarcinoma SW620 cells

LIU Jian-xin1, ZHAO Jun-yu1, JIN Xiao-ting1, LI Zhuo-yu1, SONG Li1,2

(1.InstituteofBiotechnology,KeyLaboratoryofChemicalBiologyandMolecularEngineeringofNationalMinistryofEducation,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China; 2.MOEKeyLabofEnvironmentalRemediationandEcosystemHealth,CollegeofEnvironmentalandResourceSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

OBJECTIVE To investigate the effect and mechanism of low concentrations ofp,p′-dichlorodiphenyltrichloroethane (p,p′-DDT) on colorectal adenocarcinoma SW620 cell proliferation and apoptosis. METHODS SW620 cells were exposed to low concentrations ofp,p′-DDT ranging from 1×10-12to 1×10-6mol·L-1for 48 and 96 h. MTT assay was employed to examine the effect ofp,p′-DDT on SW620 cell viability. Different cell stages of cycle and apoptosis rate were determined by flow cytometry after SW620 cells were exposed to 1×10-10, 1×10-9and 1×10-8mol·L-1for 96 h. Western blotting was used to determine the protein expression of Wnt/β-catenin signaling components 〔β-catenin, phospho-β-catenin and phospho-glycogen synthase kinase (GSK)3β〕, their downstream target proteins (c-Myc and cyclin D1)and apoptosis related proteins (Bcl-2, Bax, procaspase 8 and procaspase 3). RESULTSThe viability of colorectal adenocarcinoma SW620 cells was significantly increased after exposure to low concentrations ofp,p′-DDT ranging from 1×10-12to 1×10-7mol·L-1for 96 h.p,p′-DDT 1×10-10, 1×10-9and 1×10-8mol·L-1exposure led to a decreased percentage of SW620 cells in G1stage(P<0.01) along with an increased percentage of cells in S stage(P<0.01). Meanwhile, the apoptosis rate was significantly decreased compared with control group(P<0.01). Exposure top,p′-DDT from 1×10-10to 1×10-8mol·L-1induced upregulation of phospho-GSK3β (Ser9), β-catenin, c-Myc and cyclin D1 in SW620 cells(P<0.01). Moreover, apoptosis related proteins Bcl-2, procaspase 8 and procaspase 3 were unregulated(P<0.01), and Bax level and caspase 3 activity were decreased inp,p′-DDT-stimulated cells(P<0.01). CONCLUSION Low concentrations ofp,p′-DDT exposure activates Wnt/β-catenin signaling and affects apoptosis-related proteins, which may be involved inp,p′-DDT-induced cell proliferation as well as suppression of cell apoptosis in SW620 cells.Key words: dichlorodiphenyltrichloroethane; large intestine cancer; Wnt signaling pathway; β-catenin; Bcl-2; caspase 3

SONG Li, E-mail: lsong@sxu.edu.cn, Tel: (0351)7017774

國家自然科學基金(31271516)； 國家自然科學基金(21207084)；教育部博士點博導基金(20111401110011)；中國博士后基金(2012M521178)；山西省自然科學基金(2014011027-5)

劉建新(1989- )，男，碩士研究生，主要從事毒理學研究。

宋 莉, E-mail: lsong@sxu.edu.cn, Tel: (0351)7017774

Foundation item: The project supported by National Natural Science Foundation of China (31271516); National Natural Science Foundation of China (21207084)； Research Fund for Doctoral Program of Higher Education of China (20111401110011)；China Postdoctoral Science Foundation (2012M521178)； and Natural Science Foundation of Shanxi Province (2014011027-5)

2014-08-28 接受日期: 2015-03-19)

R965,R979.8

A

1000-3002(2015)02-0227-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.007

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