厄洛替尼時辰給藥對肺癌模型裸鼠的抑瘤作用及作用機制

林萍萍, 李明春, 劉 亮, 劉 寧, 劉 博

(1. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系, 山東 青島 266071; 2. 解放軍第401醫(yī)院藥劑科, 山東 青島 266071)

厄洛替尼時辰給藥對肺癌模型裸鼠的抑瘤作用及作用機制

林萍萍1, 李明春2, 劉 亮1, 劉 寧1, 劉 博2

(1. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系, 山東 青島 266071; 2. 解放軍第401醫(yī)院藥劑科, 山東 青島 266071)

目的 探討厄洛替尼按時辰給藥對肺癌裸鼠模型的抑瘤作用及其可能的作用機制。方法 制備HCC827人肺癌細胞皮下移植瘤裸鼠模型，并隨機分為6個厄洛替尼組和模型組，每組10只。厄洛替尼組分別在08:00, 12:00, 16:00, 20:00, 24:00及次日04:00 ig給予厄洛替尼5 mg·kg-1，模型組給予與厄洛替尼組等體積分數(shù)的溶劑磺丁基醚-β-環(huán)糊精溶液。測量21 d內(nèi)裸鼠腫瘤體積變化，處死裸鼠后剝離腫瘤并稱量其質(zhì)量，實時熒光定量PCR和Western蛋白印跡法檢測腫瘤組織中表皮生長因子受體(EGFR)及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)以及細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子1A(P21Waf1)的mRNA和相關(guān)蛋白表達水平。結(jié)果 與模型組比較，厄洛替尼08:00和次日04:00組腫瘤體積顯著縮小(P<0.05)；厄洛替尼08:00，12:00和次日04:00組腫瘤質(zhì)量顯著降低(P<0.05)。與20:00組〔(0.70±0.36)g〕比較，08:00〔(0.30±0.17)g〕和次日04:00〔(0.39±0.29)g〕組裸鼠腫瘤質(zhì)量顯著降低(P<0.05)。08:00組裸鼠腫瘤組織中EGFR和MAPK的mRNA表達水平顯著低于20:00組(P<0.05)，而P21Waf1 mRNA表達水平顯著高于模型組(P<0.05)。厄洛替尼08：00和次日04:00組p-EGFR和p-MAPK蛋白表達顯著低于模型組(P<0.05)。結(jié)論 厄洛替尼時辰給藥對裸鼠移植肺癌的抗腫瘤作用具有時辰節(jié)律性，08:00給藥組效果最佳，其作用機制可能與EGFR/MAPK/P21Waf1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

厄洛替尼; 時辰化療; 晝夜節(jié)律; 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑; 表皮生長因子

近年來，隨著個體化藥物治療的不斷發(fā)展，小分子靶向治療藥物逐漸成為抗腫瘤領(lǐng)域的研究熱點。鹽酸厄洛替尼(erlotinib hydrochloride)是一種選擇性表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸激酶抑制劑，對EGFR突變型非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)患者有顯著療效[1]。生物體的晝夜節(jié)律變化影響著抗腫瘤藥物的功效與毒性，很多藥物在不同時間給藥獲得的效果不同[2]。時辰治療是在1 d中選擇合適的時間給藥、使藥物功效最大化而毒性最小從而提高治療效果并減少不良反應(yīng)的一種治療方案[3-4]。晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)著大多數(shù)哺乳動物的生理功能和行為活動，隨著對其分子機制及下游信號通路的深入認知，如何更有效地利用現(xiàn)有藥物日漸成為研究熱點[5-6]。目前，已發(fā)現(xiàn)多種細胞毒性抗腫瘤藥物具有時辰藥理學(xué)效應(yīng)[7-8]，但小分子靶向藥物的時辰藥理學(xué)研究較少見。

厄洛替尼對EGFR突變型NSCLC療效最為顯著[9]，因而本研究采用EGFR突變型細胞HCC827皮下種植造模。根據(jù)小鼠晝夜節(jié)律特點及其他時辰藥理學(xué)研究[10-11]選取6個時辰點，根據(jù)藥物對裸鼠的半數(shù)有效量和預(yù)實驗結(jié)果，選取藥效最佳劑量5 mg·kg-1，通過探究鹽酸厄洛替尼對肺癌移植瘤裸鼠的時辰藥理學(xué)作用及其可能的分子機制，為臨床合理應(yīng)用厄洛替尼提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑RPMI 1640培養(yǎng)基(批號: NYL1029，規(guī)格：500 mL)、胰蛋白酶(批號：J130049，規(guī)格：100 mL)、胎牛血清(批號：NYE0873，規(guī)格：500 mL)和青霉素/鏈霉素雙抗(批號：J130043，規(guī)格：100 mL)均購自美國HyClone公司；鹽酸厄洛替尼片(商品名：特羅凱，意大利Roche S.p.A.公司生產(chǎn)，規(guī)格：每片含厄洛替尼150 mg，產(chǎn)品批號：M1028)；RNAiso Plus(批號：AKA105)、cDNA提取試劑盒(批號：AK2501)和RNA擴增試劑盒(批號：AK5305)均購自大連TaKaRa公司。

1.2 儀器CB150型CO2培養(yǎng)箱(德國Binder公司)；DW-86WHO型-86℃低溫保存箱(中國澳柯瑪公司)；TGL16型臺式高速冷凍離心機(長沙英泰儀器有限公司)；TL988型熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)儀(西安天隆公司)；910型電泳儀(美國Bio-Rad公司)；轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海山富科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 動物SPF級BALB/c裸鼠，♀，4周齡，體質(zhì)量10～14 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。整個實驗過程將裸鼠置于嚴格控制的人工明暗周期(明期：07:00～19:00；暗期：19:00～07:00)環(huán)境中喂養(yǎng)，維持環(huán)境溫度為22～28℃，濕度為40%～60%，自由進食進水。

1.4 細胞培養(yǎng)人非小細胞肺癌細胞HCC827，購于中國科學(xué)院細胞庫，貨號：31800022。將HCC827細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃，CO2體積分數(shù)為0.05的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)，每3 d傳代1次。

1.5 皮下移植瘤肺癌裸鼠模型制備及分組給藥收集對數(shù)生長期HCC827細胞，制成細胞懸液，調(diào)整細胞懸液濃度至1.0×1010 L-1，于裸鼠右上肢腋下皮下接種0.2 mL細胞懸液，接種4 d后肉眼可見腫瘤形成，即為腫瘤模型制備成功。待腫瘤生長至0.3～0.5 cm3時，將70只造模成功裸鼠隨機分為模型組和6個厄洛替尼時辰給藥組，每組10只，厄洛替尼組分別在08:00, 12:00, 16:00, 20:00, 24:00和次日04:00 ig給予厄洛替尼混懸液(加入6%磺丁基醚-β-環(huán)糊精作為厄洛替尼的增溶劑)5 mg·kg-1，模型組給予等體積的磺丁基醚-β-環(huán)糊精溶液。連續(xù)給藥21 d。

1.6 瘤重和抑瘤率檢測自開始給藥起，觀察裸鼠的活動、精神狀態(tài)和攝食情況[12]。每3 d用游標卡尺測量各組裸鼠腫瘤最長徑與最短徑，按照公式“體積=長徑×短徑2/2”[13]計算腫瘤體積,繪制腫瘤體積變化曲線。第21天相應(yīng)時辰點處死裸鼠，剝離腫瘤并稱瘤質(zhì)量，按照公式“抑瘤率(%)=(模型組平均瘤質(zhì)量-實驗組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量×100%”計算各組抑瘤率。

1.7 實時熒光定量PCR法檢測腫瘤組織中EGFR, 絲裂原激活蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1, MAPK1)和細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A, P21Waf1)的基因表達

1.7.1 腫瘤組織中總RNA的提取稱量超低溫凍結(jié)的裸鼠腫瘤組織100 mg，迅速轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，期間不斷加入液氮，直至研磨成粉末，充分勻漿后，按照RNA提取試劑盒操作說明書提取總RNA。

1.7.2 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA按照試劑盒要求，取已提取的總RNA于冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，進行逆轉(zhuǎn)錄操作，反應(yīng)條件為37℃，15 min；85℃，5 s。

1.7.3 PCR擴增按照引物合成說明書，將引物稀釋為10 μmol·L-1，-20℃保存?zhèn)溆茫饕镄蛄幸姳?。按PrimeScript RT reagent Kit說明進行實時PCR反應(yīng)。擴增條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。通過PCR反應(yīng)得到目的基因在各組腫瘤組織中的Ct值，用內(nèi)參基因GAPDH對目的基因的表達量進行均一化處理。取3次重復(fù)結(jié)果的平均Ct值，2-ΔΔCt表示基因的相對表達量。

Tab.1 Primer sequences of EGFR，MAPK1，P21Waf1 and GAPDH for real-time quantitative PCR

Gene SequenceLength/bpEGFRF：5′?CATCCAGGCCCAACTGTGAG?3′20R：5′?CAGTGGAAGCCTTGAAGCAGAA?3′22MAPK1F：5′?CGTTGGTACAGGGCTCCAGAA?3′21R：5′?CTGCCAGAATGCAGCCTACAGA?3′22P21Waf1F：5′?TCAAATCGTCCAGCGACCTTC?3′21R：5′?CATGCCCTGTCCATAGCCTCTAC?3′23GAPDHF：5′?GCACCGTCAAGGCTGAGAAC?3′20R：5′?TGGTGAAGACGCCAGTGGA?3′19

EGFR: epidermal growth factor receptor;MAPK1: mitogen-activated protein kinase 1;P21Waf1: cyclin-dependent kinase inhibitor 1A;GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

1.8 Western蛋白印跡法檢測腫瘤組織中EGFR, p-EGFR, MAPK和p-MAPK蛋白表達

1.8.1 腫瘤組織中總蛋白的提取取100 mg超低溫凍存組織于預(yù)冷研缽中，用研杵研磨組織，期間不斷加入液氮，直至研磨成粉末。加入1 mL裂解液(細胞裂解液∶PMSF∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1)充分勻漿后，冰上靜置30 min，高速離心機9139×g，4℃離心10 min收集上清液。BCA法測蛋白含量，加入上樣緩沖液配制成相同濃度蛋白樣品，95℃煮沸10 min變性，于-80℃保存。1.8.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及轉(zhuǎn)膜 配制10%SDS-PAGE凝膠，將各組蛋白樣品等量上樣進行電泳。采用濕法轉(zhuǎn)膜，將各組蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。

1.8.3 抗原抗體反應(yīng)及顯影5%脫脂奶粉封閉2 h后，4℃一抗孵育過夜，PBST洗膜。37℃二抗搖床孵育1 h后PBS洗膜。將PVDF膜放入DAB顯影劑和定影劑各150 μL的混合溶液中反應(yīng)約1 min，置于化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀中顯影拍照，用凝膠分析軟件Quantity One進行積分吸光度值分析，用目標蛋白與內(nèi)標蛋白積分吸光度比值表示蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 厄洛替尼時辰給藥對肺癌模型裸鼠腫瘤體積的影響由圖1可見，模型組腫瘤呈迅速生長趨勢，厄洛替尼組裸鼠腫瘤生長較模型組均有所減緩，其中，08:00組腫瘤生長曲線最為平緩，次日04:00組次之，20:00趨勢與模型相近。與模型組相比，08:00組和次日04:00組裸鼠21 d內(nèi)腫瘤體積顯著縮小(P<0.05)。

2.2 厄洛替尼時辰給藥對肺癌模型裸鼠腫瘤質(zhì)量的影響由表2可知，與模型組相比，厄洛替尼各給藥組腫瘤質(zhì)量均減小，08:00組裸鼠腫瘤質(zhì)量最低，04:00組次之(P<0.05)。與20:00組比較，08:00和次日04:00組裸鼠腫瘤質(zhì)量顯著降低(P<0.05)。厄洛替尼08:00組抑瘤率最高，20:00組抑瘤率最低。

Tab.2 Effect of dosing time of erlotinib on tumor mass

GroupTumormass/gGrowthinhibitoryrate/%Model0．74±0．260．008：000．30±0．17??##59．212：000．48±0．34?34．516：000．61±0．3517．120：000．70±0．365．124：000．59±0．3219．804：000．39±0．29?#47．7

2.3 厄洛替尼時辰給藥對肺癌模型裸鼠腫瘤組織中相關(guān)基因表達的影響圖2結(jié)果顯示，與模型組相比，厄洛替尼8:00,12:00和16:00組裸鼠腫瘤組織中EGFR和MAPK1的相對表達量顯著降低(P<0.05)，但08:00組裸鼠腫瘤組織中P21Waf1的相對表達量明顯升高(P<0.05)；與20:00組相比，08:00組腫瘤組織中EGFR的相對表達量及08:00, 12:00和16:00組腫瘤組織中MAPK1的相對表達量顯著降低(P<0.05)。

2.4 厄洛替尼時辰給藥對肺癌模型裸鼠腫瘤組織中相關(guān)蛋白表達的影響與模型組相比，厄洛替尼組裸鼠腫瘤組織中EGFR和MAPK蛋白的相對表達量無顯著性差異(數(shù)據(jù)略)，但8:00和04:00組p-EGFR和p-MAPK蛋白的相對表達量顯著降低(P<0.05)(圖3)。

3 討論

本研究結(jié)果表明，在不同時辰點厄洛替尼對EGFR突變型肺癌模型裸鼠的抗腫瘤效果不同，且08:00組療效最好，這與我們先前藥動學(xué)的研究結(jié)果一致[14]。目前，厄洛替尼的時辰藥理學(xué)作用機制尚未明確。但此類研究已發(fā)現(xiàn)，一些抗腫瘤藥物具有時辰藥理學(xué)作用是其作用靶點及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中某些激酶活動呈現(xiàn)節(jié)律性所致[10-11]。EGFR是HER家族成員之一，是NSCLC治療的關(guān)鍵靶點。當(dāng)配體連接到EGFR的細胞外結(jié)構(gòu)域時，它會與另一EGFR分子或者其他HER家族成員組合成二聚體從而完成自身的磷酸化。磷酸化的EGFR進一步激活其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路， ERK/MAPK通路即為其中一條，它在調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和代謝等多種細胞活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。厄洛替尼通過抑制EGFR的自磷酸化而阻斷其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制腫瘤細胞生長增殖。細胞周期調(diào)控異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制，腫瘤抑制蛋白P21Waf1是ERK/MAPK通路的下游因子，可通過與CDK2復(fù)合體結(jié)合而抑制G1期細胞周期進程。因此，考慮厄洛替尼的時辰作用機制可能與ERK/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)因子呈時辰節(jié)律性表達有關(guān)。而本研究結(jié)果顯示，EGFR, MAPK, P21Waf1的基因表達及p-EGFR和p-MAPK蛋白表達的確存在時辰差異。哺乳動物近似晝夜節(jié)律的腦內(nèi)控制機制，目前普遍認為與下丘腦上的視交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)有關(guān)，它是哺乳動物生物鐘的主要振蕩器。有研究表明，EGFR和EGFR配體的表達貫穿整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在SCN對晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[16-17]。因此，p-EGFR表達呈現(xiàn)節(jié)律性的一個可能機制是一些呈現(xiàn)節(jié)律性表達的EGF家族配體與EGFR相結(jié)合，調(diào)節(jié)EGFR的二聚化，繼而使EGFR的自磷酸化也呈現(xiàn)出一定的時辰節(jié)律性[18]。另外，這些EGF家族的配體與EGFR結(jié)合的數(shù)量可能在各個時辰點有所不同，這也可能引起p-EGFR的節(jié)律性表達。而在SCN中，EGFR的活化可引起MAPK的磷酸化[19]，因此，本研究結(jié)果中p-MAPK蛋白表達與p-EGFR蛋白表達存在相似的趨勢。編碼EGFR的基因被認為是一種致癌基因[20]，EGFR與眾多腫瘤生長進程有關(guān)。因此，厄洛替尼的抗腫瘤效果存在時辰節(jié)律性可能是由于其介導(dǎo)的對EGFR/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制存在時辰變化所致。本研究結(jié)果將有助于優(yōu)化厄洛替尼給藥方案，為進一步的臨床試驗提供參考。然而，各信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間錯綜復(fù)雜、交織成網(wǎng)，更為詳盡的分子機制仍需深入探究。另外，厄洛替尼主要代謝酶的表達是否具有時辰差異也需進一步研究。

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(本文編輯: 喬 虹)

Inhibitory effect of chronopharmaceutical drug delivery of erlotinibin lung cancer nude mice model and its mechanism

LIN Ping-ping1, LI Ming-chun2, LIU Liang1, LIU Ning1, LIU Bo2

(1.DepartmentofPharmacology,MedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao266071,China;2.PharmacyDepartment, №.401HospitalofPeople′sLiberationArmy,Qingdao266071,China)

OBJECTIVE To investigate the pharmacodynamics of chronopharmaceutical drug delivery of erlotinib in lung cancer model nude mice and its potential mechanism. METHODS A nude mouse model of human lung adenocarcinoma HCC827 cell subcutaneously implanted tumor was established and subsequently the nude mice were randomly divided into 6 erlotinib groups and a model group, with 10 nude mouse per group. Erlotinib groups were respectively gavaged with 5 mg·kg-1erlotinib at 08:00, 12:00, 16:00, 20:00, 24:00 and morrow 04:00, while the model group was given the same volume fraction of captisol. The tumor volume and tumor mass were measured and the tumor growth inhibitory rate was calculated. The mRNA expression of epidermal growth factor receptor (EGFR), mitogen-activated protein kinase (MAPK), cyclin-dependent kinase inhibitor 1A(P21Waf1) and the related protein level were detected by real-time quantitative PCR and Western blotting. RESULTS Compared with model group, the tumor volume and tumor mass of mice at the dosing time of 08:00 and morrow 04:00 were significantly decreased(P<0.05). Compared with dosing time at 20:00 group〔(0.70±0.36)g〕, the tumor mass of 08:00 group〔(0.30±0.17)g〕 and morrow 04:00〔(0.39±0.29)g〕 group was significantly decreased(P<0.05). The mRNA expression of EGFR and MAPK in the tumor group of 08:00 was lower than in group of 20:00(P<0.05), while the mRNA expression of P21Waf1 was significantly higher than that of model group(P<0.05). Compared with model group, the protein expression of p-EGFR and p-MAPK in tumor 08:00 and morrow 04:00 group was negative-regulated significantly(P<0.05). CONCLUSION The antitumor effect of erlotinib on the human lung adenocarcinoma implanted tumor nude mice model presents rhythmicity. The dosing time at 08:00 is the most effective. Its mechanism is likely related to EGFR/MAPK/P21Waf1 signal transduction pathway.Key words: erlotinib; chronochemotherapy; circadian rhythms; signal transduction pathway; epidermal growth factor

LI Ming-chun, Tel: (0531)51870086, E-mail: lmc401y@163.com

林萍萍，女，碩士研究生, 主要從事藥理學(xué)研究。

李明春，Tel: (0531)51870086, E-mail: lmc401y@163.com

2014-11-02 接受日期: 2015-03-02)

R96,R979.1

A

1000-3002(2015)02-0234-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.008

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