多硫代二酮哌嗪類化合物C87體外對腫瘤細胞生長的抑制作用及對活性氧產生的影響

高藝洋, 魏曉莉, 楊曉雯, 任鳳霞, 鄭建全, 鄭志兵, 蘇瑞斌

(1. 廣西醫科大學藥學院, 廣西 南寧 530021; 2. 抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室,軍事醫學科學院毒物藥物研究所軍事毒理與生化藥理研究室, 北京 100850)

多硫代二酮哌嗪類化合物C87體外對腫瘤細胞生長的抑制作用及對活性氧產生的影響

高藝洋1,2, 魏曉莉2, 楊曉雯2, 任鳳霞2, 鄭建全2, 鄭志兵1,2, 蘇瑞斌1,2

(1. 廣西醫科大學藥學院, 廣西 南寧 530021; 2. 抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室,軍事醫學科學院毒物藥物研究所軍事毒理與生化藥理研究室, 北京 100850)

目的 研究多硫代二酮哌嗪類化合物C87對腫瘤細胞生長的影響及其可能機制。方法 用磺酰羅丹明B法觀察C87 0.05～1 μmol·L-1與A549，HCT116，HeLa和SMMC7721作用24，48和72 h對腫瘤細胞存活率的影響，并計算50%生長抑制濃度(GI50)；用流式細胞術檢測C87 0.1～2.5 μmol·L-1作用HCT116和HeLa細胞6 h, C87 2.5 μmol·L-1作用0～6 h活性氧(ROS) 的生成量；用流式細胞術檢測C87 2.5 μmol·L-1伴隨給予抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)作用HCT116和HeLa細胞6 h ROS的生成量；用SRB法觀察C87 0.05～1 μmol·L-1伴隨給予NAC作用24和48 h對HCT116細胞存活率的影響。結果C87 0.05～1 μmol·L-1作用24，48和72 h，可明顯抑制A549, HCT116, HeLa和SMMC7721細胞存活(P<0.05)，且具有濃度依賴性(72 h，r2=0.946，0.989，0.973和0.984 ，P<0.05)；C87 1 μmol·L-1與上述4種腫瘤細胞作用24, 48和72 h能時間依賴性地抑制細胞存活(r2=0.983，0.956，0.951和0.873,P<0.05)。C87 0.25～2.5 μmol·L-1與HeLa細胞和HCT116細胞作用6 h，可誘發細胞內ROS產生，且呈濃度依賴性 (r2=0.760,P=0.045;r2=0.987,P=0.001)；C87 2.5 μmol·L-1作用0.5～6 h，誘導ROS的產生呈時間依賴性 (r2=0.886,P=0.017;r2=0.994,P=0.000)。給予抗氧化劑NAC后能明顯抑制C87引起的HeLa細胞和HCT116細胞ROS生成(P<0.05 )，NAC 5和10 mmol·L-1可明顯逆轉C87引起的HCT116細胞死亡，GI50值明顯增大，作用24 h時GI50為1.446和1.134 μmol·L-1(C87處理組為0.513 μmol·L-1)；處理48 h時GI50為0.882和1.166 μmol·L-1(C87處理組為0.333 μmol·L-1)。結論 化合物C87對A549, HCT116, HeLa和SMMC7721腫瘤細胞的生長具有抑制作用，其機制可能與其誘導細胞內氧化應激有關。

多硫代二酮哌嗪類化合物; C87; 腫瘤細胞, 培養的; 活性氧

多硫代二酮哌嗪類化合物 (epipolythiodioxopiperazines, ETP) 是由真菌產生的一類次級代謝產物，具有廣泛的生物學活性，包括抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫抑制及抑制多種酶活性(如拓撲異構酶、酪氨酸激酶、ATP合酶)等[1-5]。ETP類化合物以含有硫橋鍵的二酮哌嗪母核為結構特征，硫橋鍵是其生物活性的關鍵基團，去除或斷裂硫橋通常會導致其生物活性喪失[6-9]。因ETP類化合物結構新穎，立體化學獨特，骨架類型多樣，所以其活性研究一直備受關注。

近年來，本研究集體從真菌次級代謝產物中獲得多個新的ETP類化合物。前期體外細胞實驗研究顯示，多個化合物對多種腫瘤細胞生長具有明顯的抑制活性，其中C87對腫瘤細胞生長的抑制作用最為明顯。因此，本研究在細胞水平評價ETP類化合物C87(圖1)的抗腫瘤活性，并探討其可能的作用機制。

Fig.1 Chemical structure of novel epipolythiodioxopiperazine compound C87.

1 材料與方法

1.1 藥品、細胞、試劑和儀器C87為從冬蟲夏草定殖真菌黏帚霉素屬(Gliocladium sp.)的發酵產物中獲得的ETP類化合物，以高效液相色譜法測定其純度為95%。人肺癌A549細胞和人結腸癌HCT116細胞分別由本研究所王玉霞研究員和關勇彪研究員饋贈；人宮頸癌HeLa細胞和人肝癌SMMC7721細胞由本實驗室保存。DMEM高糖培養基和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 購自美國Gibco公司；三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)、磺酰羅丹明B(sulforhodamine B, SRB)、二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO) 和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC) 購自美國Sigma公司；活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。CKX41倒置顯微鏡和BX51熒光顯微鏡，日本Olympus公司；GENios Pro多功能酶標儀, 澳大利亞Tecan公司；FACS Calibur流式細胞儀, 美國BD公司；BS214D電子天平, 德國Sartorius公司；MCO-15AC二氧化碳培養箱，日本Sanyo公司。

1.2 細胞培養A549, HCT116, HeLa和SMMC7721細胞培養于含有10%FBS的DMEM培養基 (高糖)，置于37℃，5%CO2的細胞培養箱內培養，待細胞生長至80%融合時，用0.25%胰酶消化、傳代，取對數生長期細胞進行以下實驗。

1.3 SRB法檢測腫瘤細胞存活率

1.3.1 C87對腫瘤細胞存活率影響的檢測將處于對數生長期的A549, HCT116, HeLa和SMMC7721細胞，消化后制成細胞懸液，調整細胞密度為A549細胞5×107L-1，HCT116細胞7×107L-1，HeLa細胞5×107L-1，SMMC7721細胞6×107L-1，每孔100 μL接種于96孔板內，培養24 h后棄培養基，每孔加入用DMEM培養基稀釋的不同濃度C87 (終濃度0.05, 0.1, 0.25, 0.5和1 μmol·L-1)100 μL，每組設3復孔，對照組加入含0.1%DMSO的DMEM 100 μL，繼續培養24，48和72 h后棄培養基，每孔加入10%TCA溶液100 μL固定細胞，4℃放置1 h，棄上清，用去離子水洗滌4次。干燥后每孔加入0.4%SRB溶液100 μL，室溫下孵育30 min，棄上清，用1%醋酸溶液洗滌5次。干燥后每孔加10 mmol·L-1Tris溶液 (pH=10.5)100μL溶解，低速搖床上振蕩10 min，酶標儀562 nm波長下處測定各孔吸光度(A562 nm)。細胞存活率(%)=(實驗組A562 nm-空白孔A562 nm)/(對照組A562 nm-空白孔A562 nm)×100%。

1.3.2 抗氧化劑對C87抑制腫瘤細胞存活影響的檢測將處于對數生長期的HCT116細胞經消化后制成細胞懸液，調整細胞密度為7×107L-1，每孔100 μL接種于96孔板內，培養24 h后棄舊培養基，一組中每孔加入含有抗氧化劑NAC(5 mmol·L-1)的DMEM培養基100 μL處理30 min后，加入用含有NAC(5 mmol·L-1)的DMEM培養基稀釋的不同濃度C87 100 μL，C87終濃度為0, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5和1 μmol·L-1；另一組中每孔加入用DMEM培養基稀釋的不同濃度C87 100 μL，C87終濃度為0, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5和1 μmol·L-1，對照組加入含有0.1%DMSO的DMEM培養基，每組設3復孔，具體方法同1.3.1。

1.4 流式細胞術檢測細胞活性氧的產生

1.4.1 C87對腫瘤細胞活性氧產生影響的檢測取對數生長期的HCT116和HeLa細胞接種于6孔板中培養 (每孔3×105)，培養24 h后棄舊培養基，每孔加入用DMEM培養基稀釋的不同濃度C87(終濃度0.25, 0.5, 1和2.5 μmol·L-1)2 mL，對照組不加藥物，更換新鮮培養基。每組設3復孔，繼續培養0.5，2，4和6 h后消化細胞，用舊培養基終止消化，200×g離心4 min，棄上清。用無血清培養基稀釋2′,7′-二氯熒光乙酰乙酸鹽 (2′,7′-dichlorofluoresceindiacetate，DCFH-DA)，使其終濃度為10 μmol·L-1，用稀釋好的DCFH-DA懸浮細胞，37℃細胞培養箱內孵育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻一下。用無血清培養基洗滌細胞3次后細胞重懸于無血清培養基中。用流式細胞儀檢測，激發波長為488 nm，發射波長為525 nm，測量熒光強度。

1.4.2 抗氧化劑對C87誘導腫瘤細胞活性氧產生影響的檢測取對數生長期的HCT116和HeLa細胞接種于6孔板中培養 (每孔3×105)，培養24 h后棄舊培養基，一組中2孔加入含有抗氧化劑NAC(5 mmol·L-1)的DMEM培養基2 mL處理30 min后，其中一孔棄舊培養基后加入用含有NAC(5 mmol·L-1)的DMEM培養基稀釋的C87(2.5 μmol·L-1)2 mL；另一組一孔加入用DMEM培養基稀釋的C87(2.5 μmol·L-1)2 mL，對照組加入含有0.1%DMSO的DMEM培養基，繼續培養6 h，具體方法同1.4.1。

2 結果

2.1 C87對不同組織類型腫瘤細胞存活率的影響圖2結果表明，肝癌SMMC7721、人肺癌A549、

2.2 C87對不同組織類型腫瘤細胞發生氧化應激的影響圖3結果表明，C87 0.25～2.5 μmol·L-1與HCT116和HeLa細胞作用6 h，可誘發細胞內ROS產生，且呈濃度依賴性(r2=0.760, P=0.045; r2=0.987, P=0.001)。圖4結果表明，C87 2.5 μmol·L-1與HCT116和HeLa細胞作用0.5～6 h，ROS的產生呈時間依賴性 (r2=0.886, P=0.017; r2=0.994, P=0.000)。

2.3 抗氧化劑NAC對C87誘導ROS生成的影響圖5結果表明，NAC預處理30 min后給予C87 2.5 μmol·L-1作用于HeLa和HCT116細胞6 h，C87可以明顯增加細胞ROS的生成，NAC可以減少細胞ROS的生成；與C87單獨給藥組相比，NAC和C87聯合作用可以明顯減少ROS的生成(P<0.01)。采用2×2析因設計的方差分析對NAC和C87對細胞ROS產生的影響以及二者的交互作用進行分析，結果表明，與對照組比較，單獨給予C87細胞內ROS的產生具有顯著性差異(F=9183，P=0.000)；與對照組比較，單獨給予NAC，細胞內ROS的產生具有顯著性差異(F=9183，P=0.000)；并且2種藥物存在明顯的交互作用(F=1666，P=0.000); 組間兩兩比較提示，NAC 5 mmol·L-1能明顯抑制C87誘導的ROS產生(P<0.01)。

2.4 抗氧化劑NAC對C87引起的細胞生長抑制的影響圖6結果表明，聯合給以不同濃度NAC 5和10 mmol·L-1及不同濃度C87 0.05, 0.1, 0.25, 0.5和1 μmol·L-1處理HCT116細胞24和48 h后，C87可濃度依賴性地抑制HCT116細胞的生長，24 h：r2=0.969, P=0.000; 48 h：r2=0.857, P=0.008。NAC 5和10 mmol·L-1單獨作用不影響細胞生長，但可使C87的生長抑制曲線向右偏移，提示NAC可部分逆轉C87對細胞生長的抑制作用。計算C87的GI50值，作用24 h，C87, NAC 5 mmol·L-1+C87和NAC 10 mmol·L-1+C87時C87的GI50分別為0.513，1.446和1.134 μmol·L-1。作用48 h，C87, NAC 5 mmol·L-1+C87和NAC 10 mmol·L-1+C87時C87的GI50分別為0.333，0.882和1.166 μmol·L-1。NAC 5 mmol·L-1+C87和NAC 10 mmol·L-1+C87條件下C87的GI50約為C87單用時GI50的2或3倍以上。

3 討論

ETP類化合物是由2個氨基酸環合形成的含硫橋鍵的二酮哌嗪母核類化合物[10]。我們在前期篩選中發現，新的ETP類化合物C87在HeLa, HCT116, SMMC7721, A549, H460, H1993和MDA-MB-231等多種腫瘤細胞系上均具有非常顯著的細胞生長抑制活性。本研究主要用HCT116, A549, SMMC7721和HeLa 4種細胞觀察C87對細胞生長的抑制活性及機制。鑒于ETP類化合物的硫橋鍵可能是其主要的功能基團，在進入細胞后有可能參與細胞內的氧化還原循環，誘導細胞發生氧化應激[9]，因此，本研究主要對C87處理后細胞內ROS的產生進行測定，并觀察抗氧化劑NAC對C87抑制腫瘤細胞生長的影響。本研究結果顯示，化合物C87可時間和濃度依賴性地誘導腫瘤細胞內ROS產生，其中用2.5 μmol·L-1刺激6 h時可觀察到ROS大量產生，產量達對照組的5～7倍。給予抗氧化劑NAC后能明顯抑制C87引起的ROS產生，并且可以明顯逆轉C87對細胞生長的抑制作用，提示C87處理后產生的細胞內氧化應激與其對腫瘤細胞生長抑制作用密切相關。然而，從作用24和48 h的細胞存活率測定結果均可見，C87的細胞生長抑制效應并不能被NAC完全逆轉。這一方面提示，除了誘導氧化應激導致細胞損傷外，C87可能還有其他的作用機制；另一方面，在體外實驗中，NAC作為抗氧化劑，其給藥濃度和作用時間的限制可能也是導致其只有部分拮抗作用的原因。ROS包括氧自由基、羥自由基和過氧化氫等多種自由基類型，參與細胞增殖、分化、衰老和凋亡等多種生理和病理過程。正常水平的ROS對許多氧化還原依賴性細胞信號轉導過程是必需的；當細胞受到不同類型的外源性刺激時，過量產生的不同來源的ROS可引起細胞內氧化應激，從而導致細胞內許多分子發生化學修飾或活性改變，最終使細胞損傷或死亡[11]。C87主要誘導哪種類型的ROS產生及其引起細胞損傷的機制尚有待進一步研究。另有研究報道，ETP類化合物可以通過激活p53信號通路誘導細胞周期發生G2/M期阻斷[12]，并可抑制酪氨酸激酶活性[13]，顯示對新生血管的抑制作用[14]。作為一種新的ETP類化合物，C87是否也通過上述機制發揮抗腫瘤作用，以及其是否在動物體內仍具有有效的抗腫瘤活性非常值得進一步研究。本研究結果表明，ETP類化合物C87通過誘導細胞內氧化應激，可顯著抑制多種腫瘤細胞的生長，但此類化合物最終發展成為新結構類型的抗腫瘤藥物尚需進一步研究。總之，目前有關ETP類化合物的研究均表明該類化合物有較好的生物學活性，本研究對闡明其結構與功能關系、以及分子作用機制等均提供了重要的實驗依據。

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(本文編輯: 齊春會)

Suppression of epipolythiodioxopiperazine compound C87on growth of tumor cells and its effect on productionof reactive oxygen species

GAO Yi-yang1,2, WEI Xiao-li2, YANG Xiao-wen2, REN Feng-xia2, ZHENG Jian-quan2,ZHENG Zhi-bing1,2, SU Rui-bin1,2

(1.PharmaceuticalCollege,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China; 2.StateKeyLaboratoryofToxicologyandMedicalCountermeasures,DepartmentofMilitaryToxicologyandBiochemicalPharmacology,InstituteofPharmacologyandToxicology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China)

OBJECTIVE To study the effect of epipolythiodioxopiperazine compound C87 on tumor cell proliferation and explore the potential mechanisms. METHODS Tumor cells were exposed to C87 0.05-1 μmol·L-1for 24, 48 and 72 h, cell viability was determined by sulforhodamine B (SRB) assay and the half growth inhibition (GI50) was calculated. After treatment with C87 0.1-2.5 μmol·L-1for 6 h, or C87 2.5 μmol·L-1for 0-6 h, the generation of reactive oxygen species (ROS) was measured using the compound 2′,7′-dichlorofluoresceindiacetate and flow cytometry analysis. After treatment with C87 2.5 μmol·L-1, either alone or with antioxidant N-acetylcysteine (NAC), for 6 h, the generation of ROS was measured by flow cytometry analysis. Tumor cells were exposed to C87 0.05-1 μmol·L-1, either alone or with NAC, for 24 and 48 h, while cell viability was determined by SRB assay. RESULTS The cell viability was significantly reduced following exposure to C87 0.05-1 μmol·L-1for 24, 48 and 72 h in a concentration-dependent manner in A549, HCT116, HeLa and SMMC7721 cells(P<0.05). At 72 h, the value ofr2was 0.946, 0.989, 0.973 and 0.984(P<0.05), respectively. The cell viability was significantly reduced following exposure to C87 1 μmol·L-1for 24-72 h in a time-dependent manner in A549, HCT116, HeLa and SMMC7721 cells(P<0.05). The value ofr2was 0.983, 0.956, 0.951 and 0.873(P<0.05), respectively. The generation of ROS was increased after exposure to C87 0.25-2.5 μmol·L-1in a concentration-dependent manner in HCT116 and HeLa cells for 6 h (r2=0.760,P=0.045;r2=0.987,P=0.001), and after exposure to C87 2.5 μmol·L-1in a time-dependent manner in HCT116 and HeLa cells for 0.5-6 h (r2=0.886,P=0.017;r2=0.994,P=0.000).The C87-induced ROS generation could be blocked by NAC in HCT116 and HeLa cells(P<0.05). The C87 induced cell death could be blocked by NAC 5 and 10 mmol·L-1, and the GI50value was 1.446 and 1.134 μmol·L-1for 24 h (the GI50value of C87 group was 0.513 μmol·L-1), and 0.882 and 1.166 μmol·L-1for 48 h (the GI50value of C87 group was 0.333 μmol·L-1). CONCLUSION The novel epipolythiodioxopiperazine derivative C87 exerts potent antitumor activityinvitro, possibly via triggering ROS production.Key words: epipolythiodioxopiperazine compound; C87; tumor cells, cultured; reactive oxygen species

WEI Xiao-li, E-mail: weixl@bmi.ac.cn; SU Rui-bin, E-mail: ruibinsu@126.com

國家科技重大專項(2012ZX09301003)；國家自然科學基金(30973563)

高藝洋(1988-)，女，碩士研究生，主要從事腫瘤分子藥理學研究，E-mail: gaoyiyang000@163.com

魏曉莉, E-mail: weixl@bmi.ac.cn; 蘇瑞斌，E-mail: ruibinsu@126.com

Foundation item: The project supported by National Science and Technology Major Projects of China (2012ZX09301003); and National Natural Science Foundation of China (30973563)

2014-12-15 接受日期: 2015-03-12)

R979.1

A

1000-3002(2015)02-0253-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.011

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