注射用燈盞花素豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏性試驗(yàn)評(píng)價(jià)方法的比較

周 莉, 王 永, 楊春雷, 駱永偉,2, 姜 娟, 賈玉玲, 桂 博, 孫祖越

(1. 上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所藥理毒理學(xué)研究室, 中國(guó)生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測(cè)中心, 上海 200032;2. 復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院, 上海 201203; 3. 昆明龍津藥業(yè)股份有限公司, 云南 昆明 650101)

注射用燈盞花素豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏性試驗(yàn)評(píng)價(jià)方法的比較

周 莉1, 王 永1, 楊春雷3, 駱永偉1,2, 姜 娟1, 賈玉玲1, 桂 博1, 孫祖越1

(1. 上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所藥理毒理學(xué)研究室, 中國(guó)生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測(cè)中心, 上海 200032;2. 復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院, 上海 201203; 3. 昆明龍津藥業(yè)股份有限公司, 云南 昆明 650101)

目的 通過(guò)《中國(guó)藥典》2010年版一部附G中藥注射液安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則中 “過(guò)敏反應(yīng)檢查法”(以下簡(jiǎn)稱為“藥典法”)和《中藥、天然藥物免疫毒性(過(guò)敏性、光過(guò)敏反應(yīng))研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》2005版中載明的方法(以下簡(jiǎn)稱為“指導(dǎo)原則法”)分別評(píng)價(jià)并比較燈盞花素對(duì)豚鼠全身過(guò)敏反應(yīng)，為藥物臨床前安全評(píng)價(jià)提供參考。方法 將豚鼠分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、注射用燈盞花素5和50 mg·kg-1組，分別按照“藥典法”和“指導(dǎo)原則法”觀察豚鼠對(duì)注射用燈盞花素全身主動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)。致敏階段，豚鼠ip給予注射用燈盞花素溶液每只0.5 mL，劑量分別為5和50 mg·kg-1，隔日1次，共3次。“藥典法”在首次致敏后第14和21天ip給予注射用燈盞花素每只1 mL激發(fā)；“指導(dǎo)原則法”在末次注射后第12天激發(fā)1次，觀察豚鼠的過(guò)敏癥狀和過(guò)敏時(shí)間。結(jié)果 “藥典法”：第1次激發(fā)(首次致敏后第14天)注射用燈盞花素5 mg·kg-1組在不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)噴嚏1聲和(或)搔鼻1次的現(xiàn)象，注射用燈盞花素50 mg·kg-1組不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)噴嚏1聲或2聲和(或)搔鼻1次等現(xiàn)象，判定過(guò)敏反應(yīng)陰性。第2次激發(fā)(首次致敏后第21天)燈盞花素5 mg·kg-1組給藥后分別在不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)發(fā)抖、噴嚏1聲或2聲和(或)搔鼻1次的現(xiàn)象，判定過(guò)敏反應(yīng)陰性；注射用燈盞花素劑量50 mg·kg-1組4只豚鼠(4/4)給藥后在不同時(shí)間點(diǎn)分別出現(xiàn)噴嚏1聲和3聲、咳嗽1聲和2聲、搔鼻1次以及排尿等現(xiàn)象；1只豚鼠(1/4)出現(xiàn)連續(xù)噴嚏3聲和發(fā)抖，判定過(guò)敏反應(yīng)陽(yáng)性。“指導(dǎo)原則法”：末次注射后第12天激發(fā)，注射用燈盞花素5 mg·kg-1組激發(fā)后10 min內(nèi)均出現(xiàn)了不同程度的過(guò)敏反應(yīng)癥狀，其中3只豚鼠出現(xiàn)搔鼻癥狀，為弱陽(yáng)性；3只豚鼠出現(xiàn)噴嚏和(或)排尿癥狀，為陽(yáng)性。注射用燈盞花素50 mg·kg-1組過(guò)敏癥狀包括搔鼻、噴嚏、咳嗽和(或)排尿癥狀，為陽(yáng)性。結(jié)論 在進(jìn)行臨床前安全性評(píng)價(jià)豚鼠全身過(guò)敏試驗(yàn)過(guò)程中，從動(dòng)物數(shù)量、評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)、觀察時(shí)間和劑量設(shè)置等多方面要采取2種方法的優(yōu)勢(shì)，利用“藥典法”對(duì)供試品進(jìn)行初篩，一旦有疑似反應(yīng)，最好采用“指導(dǎo)原則法”進(jìn)行更加細(xì)致的觀察。

燈盞花素; 超敏反應(yīng); 藥物評(píng)價(jià), 臨床前

超敏反應(yīng)指機(jī)體受同一抗原再刺激后產(chǎn)生的一種表現(xiàn)為組織損傷或生理功能紊亂的特異性免疫反應(yīng)，是異常或病理性免疫反應(yīng)[1]。過(guò)敏試驗(yàn)是藥物臨床前安全性研究中一項(xiàng)重要的內(nèi)容。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，臨床前中藥注射劑安全性評(píng)價(jià)過(guò)敏反應(yīng)的高陰性率與臨床出現(xiàn)較多過(guò)敏反應(yīng)的結(jié)果不一致的現(xiàn)象，促使研究人員思考如何提高臨床前過(guò)敏試驗(yàn)靈敏度[2]以及《中國(guó)藥典》2010年版一部附G中藥注射液安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則中 “過(guò)敏反應(yīng)檢查法”(以下稱“藥典法”)[3]和《中藥、天然藥物免疫毒性(過(guò)敏性、光過(guò)敏反應(yīng))研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》(以下稱“指導(dǎo)原則法”)[4]中收載的豚鼠過(guò)敏試驗(yàn)方法是否能嚴(yán)格控制藥品的安全性，以及與過(guò)敏反應(yīng)與實(shí)驗(yàn)方案中的劑量設(shè)計(jì)、激發(fā)途徑和致敏次數(shù)等是否有關(guān)等問(wèn)題。注射用燈盞花素(野黃芩苷)是從菊科植物燈盞花中提取的黃酮類活性成分制成的中藥制劑，具有輕度強(qiáng)心、擴(kuò)張微細(xì)血管、提高心肌功能、改善心腦供血和降低白細(xì)胞自發(fā)活化率等藥理作用，臨床上常用于心腦血管疾病的治療。近年來(lái)，注射用燈盞花素等中藥注射劑在臨床上廣泛應(yīng)用，不良反應(yīng)報(bào)道也逐漸增多，主要表現(xiàn)為皮膚瘙癢、蕁麻疹和過(guò)敏性皮炎等過(guò)敏樣反應(yīng)。本研究參照“藥典法”和“指導(dǎo)原則法”2種評(píng)價(jià)方法，對(duì)注射用燈盞花素的全身主動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)差異進(jìn)行比較，并為臨床前安全性評(píng)價(jià)研究中全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)評(píng)價(jià)方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物豚鼠(Hartley品系，0009131)，56只，雌雄各半，4月齡，上海生旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2007-0007。豚鼠飼養(yǎng)在上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所(中國(guó)生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測(cè)中心)普通級(jí)動(dòng)物房，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(滬)2008-0027，室溫18～28℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照12～14 h，黑暗10～12 h。豚鼠飼養(yǎng)于400 mm×350 mm×200 mm塑料籠內(nèi)，同性別豚鼠每組1籠，實(shí)驗(yàn)前檢疫觀察6 d。

1.2 主要試劑注射用燈盞花素(批號(hào)：20100127)，昆明龍津藥業(yè)股份有限公司；陽(yáng)性對(duì)照牛血清白蛋白(批號(hào)：0332)，上海日出生物科技有限公司；溶媒：生理鹽水(批號(hào)：C10112606)，山東華魯制藥有限公司。

1.3 藥典法

1.3.1 分組根據(jù)體質(zhì)量將豚鼠隨機(jī)分為4組，分別為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、注射用燈盞花素5和50 mg·kg-1組，每組8只，雌雄各半。

1.3.2 劑量設(shè)置依據(jù)根據(jù)“藥典法”，注射用燈盞花素加氯化鈉注射液配制成含燈盞花素3 g·L-1的溶液，每只豚鼠每次給予0.5 mL進(jìn)行致敏，給予1.0 mL進(jìn)行激發(fā)；按照豚鼠平均體質(zhì)量300 g計(jì)算，每只給予0.5 mL，則相當(dāng)于燈盞花素5 mg·kg-1。臨床試用方案：注射用燈盞花素的臨床使用劑量為每人20～50 mg·d-1，每天1次，iv，按人均體質(zhì)量60 kg計(jì)算，臨床使用劑量為每天0.33～0.83 mg·kg-1。根據(jù)現(xiàn)有資料，以臨床最大使用劑量設(shè)為豚鼠給藥的最低劑量，約為1 mg·kg-1，以5倍的間距向上作為第2和第3劑量，第4劑量設(shè)為第3劑量的2倍，本試驗(yàn)選取第2和第4劑量考察在同種劑量下比較2種過(guò)敏反應(yīng)評(píng)價(jià)方法的差異。給藥容積0.5 mL；激發(fā)劑量均為致敏劑量的2倍，給藥容積1.0 mL。

1.3.3 試驗(yàn)方法致敏階段，豚鼠ip給予注射用燈盞花素溶液每只0.5 mL，劑量分別為5和50 mg·kg-1，隔日1次，共3次。溶媒對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組給藥方法和給藥體積同注射用燈盞花素5和50 mg·kg-1組，陽(yáng)性對(duì)照組每只給予牛血清白蛋白1～5 mg。激發(fā)階段，將致敏的豚鼠分為2組，每組4只，分別在首次致敏后第14和21天每只豚鼠iv給予注射用燈盞花素1 mL激發(fā)，注射用燈盞花素5和50 mg·kg-1組激發(fā)劑量分別為10和100 mg·kg-1，為致敏劑量的2倍。

1.3.4 結(jié)果評(píng)價(jià)iv給予燈盞花素溶液30 min內(nèi)，不得出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，如同一只豚鼠出現(xiàn)豎毛、發(fā)抖、干嘔、連續(xù)噴嚏3聲、連續(xù)咳嗽3聲、發(fā)紺和呼吸困難等現(xiàn)象中的2種或2種以上，或出現(xiàn)兩便失禁、步態(tài)不穩(wěn)或倒地、抽搐、休克和死亡現(xiàn)象之一者，判定燈盞花素的過(guò)敏反應(yīng)呈陽(yáng)性。

1.4 指導(dǎo)原則法

1.4.1 分組根據(jù)體質(zhì)量將豚鼠隨機(jī)分為4組，分別為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、注射用燈盞花素5和50 mg·kg-1組，每組6只，雌雄各半。

1.4.2 劑量設(shè)置依據(jù)根據(jù)指導(dǎo)原則法的要求，致敏采用2個(gè)劑量，低劑量組一般給予臨床最大劑量，高劑量組給予低劑量的數(shù)倍量，激發(fā)劑量一般為致敏劑量的2～5倍量，給藥容積1～2 mL；臨床試用方案：人臨床iv劑量為每人20～50 mg。

1.4.3 試驗(yàn)方法致敏階段，豚鼠iv給予注射用燈盞花素溶液，注射劑量為5和50 mg·kg-1，隔日1次，共3次。陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組給藥方法和給藥體積同注射用燈盞花素5和50 mg·kg-1組，陽(yáng)性對(duì)照組每只給予牛血清白蛋白1～5 mg。激發(fā)階段，末次注射后第12天激發(fā)1次，注射用燈盞花素5和50 mg·kg-1組激發(fā)劑量分別為20和200 mg·kg-1，為致敏劑量的4倍。

1.4.4 結(jié)果評(píng)定致敏期間，每天觀察每只豚鼠的癥狀。初次、最后1次致敏和激發(fā)當(dāng)天測(cè)定每只豚鼠的體質(zhì)量。激發(fā)階段，靜脈注射后立刻按表1癥狀詳細(xì)觀察每只豚鼠的反應(yīng)、癥狀的出現(xiàn)和消失時(shí)間，一般應(yīng)觀察3 h。按表2判斷過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生程度。計(jì)算過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生率。根據(jù)過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率和發(fā)生程度進(jìn)行綜合判斷；激發(fā)注射后，若發(fā)現(xiàn)有過(guò)敏反應(yīng)癥狀時(shí)，可取健康未致敏豚鼠2只，自iv給予激發(fā)劑量的注射用燈盞花素，觀察有無(wú)由于注射用燈盞花素引起的類似過(guò)敏反應(yīng)癥狀，以供結(jié)果判斷時(shí)參考。

Tab.1 Anaphylactic score and symptoms[4]

ScoreSymptom0Normal1Alysmus2Piloerection3Trembling4Scratchingnose5Sneezing6Cough7Ecphysesis8Micturition9Defecation10Lacimation11Dyspnea12Wheezingrale13Peliosis14Instabilityofgait15Leap16Pant17Convulsion18Circumgyration19Cheyne?Stokessign20Death

Tab.2 Criterion of active systemic anaphylaxis[4]

ScoreGradeAnaphylaxisintensity0-Negative1-4+Weaklypositive5-10++Positive11-19+++Stronglypositive20++++Extremelypositive

2 結(jié)果

2.1 致敏階段兩種試驗(yàn)方法中，豚鼠iv給予注射用燈盞花素，未觀察到豚鼠出現(xiàn)明顯異常。

2.2 “藥典法”激發(fā)豚鼠過(guò)敏癥狀

2.2.1 第1次(首次致敏后第14天)激發(fā)豚鼠過(guò)敏癥狀溶媒對(duì)照組豚鼠在激發(fā)后30 min內(nèi)均未見明顯異常和過(guò)敏體征出現(xiàn)；陽(yáng)性對(duì)照組4只豚鼠(4/4)在激發(fā)后30 min內(nèi)均出現(xiàn)了不同程度的過(guò)敏體征，包括頻繁搔鼻、連續(xù)噴嚏3聲、連續(xù)咳嗽3聲、發(fā)紺、呼吸困難、步態(tài)不穩(wěn)或倒地、痙攣或抽搐和死亡(1/4)；注射用燈盞花素5 mg·kg-1組2只豚鼠(2/4)給藥后分別在不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)噴嚏1聲和(或)搔鼻1次的現(xiàn)象；注射用燈盞花素50 mg·kg-1組4只豚鼠(4/4)分別在不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)噴嚏1聲或2聲和(或)搔鼻1次等現(xiàn)象；1只豚鼠(1/4)頻繁搔鼻，3只豚鼠(3/4)連續(xù)噴嚏3聲(表3)。

2.2.2 第2次(首次致敏后第21天)激發(fā)豚鼠過(guò)敏癥狀溶媒對(duì)照組豚鼠在激發(fā)后30 min內(nèi)均未見明顯異常和過(guò)敏體征出現(xiàn)；陽(yáng)性對(duì)照組4只豚鼠(4/4)在激發(fā)后30 min內(nèi)均出現(xiàn)了不同程度的過(guò)敏體征，包括頻繁搔鼻、連續(xù)噴嚏3聲、連續(xù)咳嗽3聲、發(fā)紺、呼吸困難、步態(tài)不穩(wěn)或倒地、痙攣或抽搐，甚至死亡(1/4)；注射用燈盞花素5 mg·kg-1組3只豚鼠(3/4)給藥后分別在不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)發(fā)抖、噴嚏1聲或2聲和(或)搔鼻1次的現(xiàn)象；注射用燈盞花素50 mg·kg-1組4只豚鼠(4/4)給藥后在不同時(shí)間點(diǎn)分別出現(xiàn)噴嚏1聲和3聲、咳嗽1聲和2聲、搔鼻1次以及排尿等現(xiàn)象；1只豚鼠(1/4)出現(xiàn)連續(xù)噴嚏3聲和發(fā)抖(表4)。

Tab.3 Result of breviscapine injection on active systemic anaphylactic reaction of guinea pigs

GroupnPrimaryprovocationMainanaphylacticreactionIncidenceofanaphylacticresponseResultofevaluationSolutionmedium4Normal0/4ComplianceBovineserumalbumin4Frequentscratchingnose，continuoussneezing3times，coughcontinuously3times，peliosis，dyspnea，instabil?ityofgaitorfall，convulsionanddeath4/4Non?complianceBreviscapineinjection5mg·kg-14Sneezingandscratchingnoserespectivelyonce0/4Compliance 50mg·kg-14Sneezingonceortwice，scratchingnoseonce；onefrequentscratchingnoseandcontinuoussneezing3times0/4Compliance

According to the ″Pharmacopoeia″ 2010 edition, an AttachedG in Traditional Chinese Medicine Injection Safety Test Application Guidelines ″Anaphylactic Reaction Test″, the results of anaphylactic reactions were observed.

Tab.4 Result of breviscapine injection on active systemic anaphylactic reaction of guinea pigs

GroupnSecondprovocationMainanaphylacticreactionIncidenceofanaphylacticresponse Resultof evaluationSoultionmedium4Normal0/4ComplianceBovineserumalbumin4Frequentlyscratchingnose，continuoussneezing3times，coughcontinuously3times，peliosis，dyspnea，instabilityofgaitorfall，convulsionanddeath4/4Non?complianceBreviscapineinjection5mg·kg-14Trembling，sneezingonceortwiceandscratchingnoseonce0/4Compliance 50mg·kg-14Trembling，sneezingonceortwice，scratchingnoseonce，cough，micturition，continuoussneezing3time1/4Non?compliance

According to the ″Pharmacopoeia″ 2010 edition, an AttachedG in Traditional Chinese Medicine Injection Safety Test Application Guidelines ″Anaphylactic Reaction Test″, the results of anaphylactic reactions were observed.

2.3 “指導(dǎo)原則法”激發(fā)豚鼠過(guò)敏癥狀

2.3.1 陽(yáng)性對(duì)照牛血清白蛋白組豚鼠過(guò)敏癥狀激發(fā)后，牛血清白蛋白組6只豚鼠在激發(fā)后10 min內(nèi)均出現(xiàn)了不同程度的過(guò)敏反應(yīng)，癥狀包括搔鼻、咳嗽、噴嚏、排尿、步態(tài)不穩(wěn)、痙攣、旋轉(zhuǎn)和死亡，為強(qiáng)陽(yáng)性或極強(qiáng)陽(yáng)性。其中3只豚鼠死亡，剩余3只豚鼠的過(guò)敏反應(yīng)癥狀在45～75 min內(nèi)基本恢復(fù)(表5)。

2.3.2 注射用燈盞花素5 mg·kg-1組豚鼠過(guò)敏癥狀6只豚鼠在激發(fā)后10 min內(nèi)均出現(xiàn)了不同程度的過(guò)敏反應(yīng)癥狀，其中3只豚鼠出現(xiàn)搔鼻癥狀，為弱陽(yáng)性；3只豚鼠出現(xiàn)噴嚏和(或)排尿癥狀，為陽(yáng)性，過(guò)敏反應(yīng)癥狀在35～50 min內(nèi)基本恢復(fù)(表5)。

2.3.3 注射用燈盞花素50 mg·kg-1組豚鼠過(guò)敏癥狀6只豚鼠在激發(fā)后10 min內(nèi)均出現(xiàn)了不同程度的過(guò)敏反應(yīng)癥狀，癥狀包括搔鼻、噴嚏、咳嗽和(或)排尿癥狀，為陽(yáng)性，過(guò)敏反應(yīng)癥狀在35～50 min內(nèi)基本恢復(fù)(表5)。

2.3.4 排除類過(guò)敏試驗(yàn)分別取健康未致敏的豚鼠2只(雌雄各1只)，分別iv給予激發(fā)劑量的高劑量組和低劑量組燈盞花素，均未觀察到過(guò)敏反應(yīng)。結(jié)合燈盞花素注射液的不良反應(yīng)在臨床上主要表現(xiàn)為過(guò)敏反應(yīng)，提示注射用燈盞花素在應(yīng)用于臨床時(shí)應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注其過(guò)敏反應(yīng)。

3 討論

隨著注射用燈盞花素等中藥注射劑在臨床上的廣泛應(yīng)用，逐漸出現(xiàn)一些中藥注射劑不良反應(yīng)的報(bào)道，臨床上燈盞花素的不良反應(yīng)主要以過(guò)敏反應(yīng)為主，嚴(yán)重的可出現(xiàn)過(guò)敏性休克[5-7]。目前評(píng)價(jià)豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)的方法主要有“藥典法”和“指導(dǎo)原則法”。本研究分別采用這2種方法評(píng)價(jià)注射用燈盞花素的全身過(guò)敏反應(yīng)，對(duì)藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)中豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)進(jìn)行比較。豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)中“藥典法”和“指導(dǎo)原則法”的區(qū)別見表6。

Tab.5 Result of breviscapine injection on active systemic anaphylactic reaction of guinea pigs

GroupnNumberofanimalswith anaphylacticreaction -++++++++++IncidenceofanaphylacticresponseAnaphylacticintensitySolutionmedium6600000/6NegativeBovineserumalbumin6000336/6StronglypositiveandextremelypositiveBreviscapineinjection5mg·kg-16033006/6Weaklypositiveandpositive 50mg·kg-16006006/6Positive

According to theTraditionalChineseMedicine,NaturalMedicineImmuneToxicity(Anaphylaxis,AnaphylacticReactionofLight)TechnologyGuidingPrinciplesin the 2005 Version, the results of anaphylactic reaction were observed.

Tab.6 Comparison of pharmacopoeia and ″Guiding Principle″ on active systemic anaphylactic reaction of guinea pigs

MethodNumberDesigndoseControlTimesofanaphylaxisProvocationdoseProvocationtimesTimeIndicator″Pharmacopoeia″61Non32timesofsensitiza?tion230minOnlyanaphylacticsym?ptomsareindicated″GuidingPrinciple″Atleast62Negativeandpositivegroup3-52-5timesofsensitiza?tion13hDetailedindicatorsshowninTab．1

動(dòng)物數(shù)目:“藥典法”規(guī)定動(dòng)物數(shù)6只，但由于分2次激發(fā)，每次僅3只豚鼠，如果藥品引起的過(guò)敏反應(yīng)比較輕微時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。而“指導(dǎo)原則法”要求每組至少6只，且1次激發(fā)，基本達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)要求的最低樣本數(shù)[8]。郭姍姍等[9]對(duì)比研究BN大鼠和豚鼠對(duì)中藥注射液過(guò)敏反應(yīng)中，同等實(shí)驗(yàn)條件下，BN大鼠各組的過(guò)敏反應(yīng)程度與豚鼠比較沒有顯著性差異，分析原因可能與實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)較少有關(guān)。劑量設(shè)置: 劑量設(shè)置中，“指導(dǎo)原則法”要求設(shè)置低和高劑量組，低劑量組給予臨床最大劑量，高劑量組給予低劑量的數(shù)倍量。“藥典法”設(shè)置1個(gè)劑量組，按照規(guī)定的劑量進(jìn)行。為與“指導(dǎo)原則法”有可比性，本研究在“藥典法”中設(shè)置低和高2個(gè)劑量組。“藥典法”結(jié)果顯示，低劑量組豚鼠2次激發(fā)后均未表現(xiàn)明顯的過(guò)敏癥狀，而高劑量組第2次激發(fā)表現(xiàn)出過(guò)敏癥狀，判斷該劑量組下注射用燈盞花素過(guò)敏反應(yīng)呈陽(yáng)性，即在此劑量下出現(xiàn)過(guò)敏體征。因此認(rèn)為，致敏劑量與過(guò)敏體征有一定關(guān)系。張德波等[10]研究也認(rèn)為，過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生與否，或表現(xiàn)出來(lái)的癥狀輕重與劑量密切相關(guān)。劑量如果太低，雖然在一定范圍內(nèi)，過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率不變化，但很可能由于過(guò)敏反應(yīng)輕微，而容易忽視所觀察到的體征。過(guò)敏反應(yīng)癥狀:“藥典法”指出，應(yīng)觀察的過(guò)敏反應(yīng)癥狀有13項(xiàng)；而“指導(dǎo)原則法”中過(guò)敏反應(yīng)癥狀為20項(xiàng)， 盡管部分指標(biāo)如不安寧和喘息等判定時(shí)可能帶有一定的主觀因素，但是這些體征描述還是可以給觀察者更好地提示作用。另外，比較2種過(guò)敏體征判定標(biāo)準(zhǔn)，“指導(dǎo)原則法”似乎更加嚴(yán)格，例如咳嗽和噴嚏等體征即使僅出現(xiàn)1次，也會(huì)記錄分值。本研究中2種方法的結(jié)果比較也說(shuō)明了這一點(diǎn)。觀察過(guò)敏癥狀時(shí)間:“藥典法”要求觀察時(shí)間為30 min，而“指導(dǎo)原則法”要求觀察時(shí)間為3 h。本研究中，部分異常體征出現(xiàn)的最早時(shí)間為激發(fā)后15或22 min，在30 min后也觀察到部分豚鼠出現(xiàn)過(guò)敏體征，按照“藥典法”這部分過(guò)敏體征將不被記入結(jié)果，因此，如果以激發(fā)后30 min為限觀察豚鼠的過(guò)敏反應(yīng)癥狀，那么有可能出現(xiàn)誤判或漏判。因此，“指導(dǎo)原則法”要求觀察的時(shí)間更為合理。致敏次數(shù):“藥典法”中要求致敏次數(shù)3次，而“指導(dǎo)原則法”中要求為3～5次。有研究認(rèn)為，若致敏次數(shù)過(guò)少，不利于抗體的產(chǎn)生，過(guò)敏反應(yīng)較弱；致敏次數(shù)太多，會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)操作成本并在致敏階段引起過(guò)敏反應(yīng)[11]。但是“指導(dǎo)原則法”給出了選擇范圍，使得實(shí)驗(yàn)人員可以根據(jù)藥物的不同特點(diǎn)來(lái)選擇合適的致敏次數(shù)。其他: “藥典法”并未規(guī)定陰性和陽(yáng)性對(duì)照組的設(shè)置，“指導(dǎo)原則法”則明確規(guī)定設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照組。豚鼠在試驗(yàn)過(guò)程中，如果食物、飲水或環(huán)境條件變化使豚鼠表現(xiàn)出一些相當(dāng)于輕微過(guò)敏的癥狀，可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)人員的判斷。因此，設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照組是必要的。“指導(dǎo)原則法”還進(jìn)一步指明，激發(fā)后，若發(fā)現(xiàn)有過(guò)敏反應(yīng)癥狀時(shí)，可取健康未致敏豚鼠2只，自靜脈注射激發(fā)劑量的受試物，觀察有無(wú)由于受試物作用引起的類似過(guò)敏反應(yīng)癥狀，以供結(jié)果判斷時(shí)參考，這種做法也會(huì)進(jìn)一步排除假陽(yáng)性。綜上所述，在進(jìn)行非臨床安全性評(píng)價(jià)豚鼠全身過(guò)敏試驗(yàn)過(guò)程中，從動(dòng)物數(shù)量、評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)、觀察時(shí)間和劑量設(shè)置等多方面，認(rèn)定“指導(dǎo)原則法”過(guò)敏體征的出現(xiàn)比較合理。因此也提示，藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)研究中，可以利用“藥典法”對(duì)供試品進(jìn)行初篩，一旦有疑似反應(yīng)，最好采用“指導(dǎo)原則法”進(jìn)行更加細(xì)致的觀察。

[1] State Food and Drug Administration. Guidance for Industry Skin Irritation, Sensitization and Erythrolysis Testing of Generic Transdermal Drug Products(化學(xué)藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則)[S]. Beijing: Chinese Medicine Science and Technology Press, 2007:116-132.

[2] Yang WF, Yu XZ, He P, Hao W, Li YK. Experimental study on anaphylactoid reactions of guinea pig induced by Danshen injection and its components[J].ChinaJChinMaterMed(中國(guó)中藥雜志), 2012, 37(13):18894-18897.

[3] National Pharmacopoeia Committee.ChinesePharmacopoeia2010 Edition of a Report ofG Traditional Chinese Medicine Injection Safety Inspection Method Guidance(《中國(guó)藥典》2010年版一部附G中藥注射液安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則)[S]. Beijing: Chinese Medicine Science and Technology Press, 2010:145.

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(本文編輯: 齊春會(huì))

“第五屆中西部?jī)嚎漆t(yī)學(xué)發(fā)展論壇”征文通知

中西部?jī)嚎漆t(yī)學(xué)發(fā)展論壇是中西部地區(qū)兒科醫(yī)學(xué)的一個(gè)學(xué)術(shù)盛會(huì)。該論壇的宗旨是“交流、合作和發(fā)展”，更好地推動(dòng)我國(guó)中西部?jī)和t(yī)療事業(yè)的持續(xù)性發(fā)展，促進(jìn)基層兒科人才成長(zhǎng)。由《兒科藥學(xué)雜志》、《中華實(shí)用兒科臨床雜志》和中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)主辦，中西部?jī)嚎漆t(yī)學(xué)發(fā)展論壇組委會(huì)和重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院承辦的第五屆中西部?jī)嚎漆t(yī)學(xué)發(fā)展論壇，定于2015年6月25-27日在重慶召開。本次會(huì)議主要針對(duì)中西部?jī)和】禒顩r和特點(diǎn)，交流和傳播實(shí)用兒科醫(yī)學(xué)知識(shí)和技術(shù)，切實(shí)解決中西部?jī)嚎漆t(yī)生工作中迫切需要解決的問(wèn)題；本屆重點(diǎn)關(guān)注“兒童營(yíng)養(yǎng)保健與發(fā)育行為、兒童呼吸道疾病和兒童感染性疾病”三大主題，重點(diǎn)關(guān)注基層兒科醫(yī)生臨床研究相關(guān)問(wèn)題；會(huì)議內(nèi)容既注重前瞻性，更具有實(shí)用性；報(bào)告形式既有專家講座，又有病例討論；既有中青年學(xué)者論壇，又有與雜志主編的面對(duì)面交流。會(huì)議將邀請(qǐng)美國(guó)、英國(guó)、加拿大及國(guó)內(nèi)院士、知名學(xué)者進(jìn)行大會(huì)演講和點(diǎn)評(píng)，相信這次會(huì)議對(duì)廣大基礎(chǔ)兒科醫(yī)生定會(huì)有所裨益。本次會(huì)議有“國(guó)家級(jí)繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育項(xiàng)目”支持。歡迎各位積極參加并踴躍投稿。

1 征文內(nèi)容① 兒童營(yíng)養(yǎng)、保健與發(fā)育行為：兒童營(yíng)養(yǎng)新進(jìn)展；兒童早期綜合發(fā)展；早產(chǎn)兒營(yíng)養(yǎng)；兒童肥胖癥；兒童生長(zhǎng)發(fā)育的促進(jìn)和評(píng)估；兒童食物過(guò)敏；環(huán)境與兒童健康；兒童行為發(fā)育問(wèn)題、障礙性疾病等。② 兒童呼吸道疾病：兒童呼吸系統(tǒng)感染性疾病；兒童哮喘及其他喘息性疾病；間質(zhì)性肺疾病；呼吸睡眠障礙；呼吸系統(tǒng)疾病的影像學(xué)、肺功能、支氣管鏡檢查等。③ 兒童感染性疾病：兒童細(xì)菌感染與對(duì)策；EB病毒感染；流感病毒感染早期識(shí)別與管理；兒童結(jié)核病；中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染；免疫缺陷與感染；不明原因發(fā)熱等。

2 征文要求① 文章內(nèi)容應(yīng)具有科學(xué)性、創(chuàng)新性和實(shí)用性；② 來(lái)搞必須是未公開發(fā)表過(guò)的學(xué)術(shù)論文；③ 論文要求500～800字摘要，內(nèi)容包括目的、方法、結(jié)果和結(jié)論4部分，格式按《兒科藥學(xué)雜志》稿約要求。一律采用Word文檔，小四號(hào)宋體。④ 來(lái)稿時(shí)注明作者姓名、單位、詳細(xì)地址、郵政編碼、聯(lián)系電話和電子郵箱。⑤ 被錄用論文將編入“會(huì)議論文集”，優(yōu)秀論文將優(yōu)先在《中華實(shí)用兒科臨床雜志》或《兒科藥學(xué)雜志》發(fā)表。

3 投稿方式稿件直接以電子郵件方式發(fā)送至?xí)?wù)組郵箱，E-mail: ekyxzz2012@163.com，郵件主題請(qǐng)注明“兒科醫(yī)學(xué)發(fā)展論壇征稿”。會(huì)議征文聯(lián)系人：劉雄志，楊 丹；電話：(023)63633143。截稿日期：2015年5月15日。

4 會(huì)議安排2010年6月25日全天報(bào)到，6月26-27日召開學(xué)術(shù)會(huì)議。會(huì)務(wù)費(fèi)800元/人(學(xué)生代表400元/人)，食宿由會(huì)務(wù)組統(tǒng)一安排，費(fèi)用自理。會(huì)議地點(diǎn)：重慶市(具體見第二輪通知)。

5 會(huì)務(wù)組聯(lián)系方式第五屆中西部?jī)嚎漆t(yī)學(xué)發(fā)展論壇會(huì)務(wù)組，地址：重慶市渝中區(qū)中山二路136號(hào)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，聯(lián)系人：曾敏莉，王樂(lè)樂(lè)，電話：(023)63633143。

第五屆中西部?jī)嚎漆t(yī)學(xué)發(fā)展論壇組委會(huì) 2015年1月

Comparison of methods for active systemic anaphylactic reactionof guinea pigs induced by breviscapine injection

ZHOU Li1, WANG Yong1, YANG Chun-lei3, LUO Yong-wei1,2, JIANG Juan1,JIA Yu-ling1,2, GUI Bo1, SUN Zu-yue1

(1.ShanghaiInstituteofPlannedParenthoodResearch&NationalEvaluationCenterforToxicologyofFertilityRegulatingDrugs,Shanghai200032,China; 2.SchoolofPharmacy,FudanUniversity,Shanghai201203,China; 3.KunmingLongjinPharmaceuticalCompany,Kunming650101,China)

OBJECTIVE To compare the difference of methods for active systemic anaphylactic reaction induced by breviscapine injection between ″Pharmacopoeia″ 2010 edition, an AttachedG in Traditional Chinese Medicine Injection Safety Test Application Guidelines ″ Anaphylactic Reaction Test″(thereafter referred to as the method of ″Pharmacopoeia″) and the Traditional Chinese Medicine, Natural Medicine Immune Toxicity (Anaphylaxis, Anaphylactic Reaction of Light) Technology Guiding Principles in the 2005 Version (thereafter referred to as the method of ″Guiding Principle″) and provide reference for non-clinical safety evaluation of drugs. METHODS According to the methods of ″Pharmacopoeia″ and ″Guiding Principle″, respectively, the effect of breviscapine injection on active systemic anaphylactic reaction of guinea pigs was investigated. The guinea pigs were divided into four groups, negative control group, positive control group, breviscapine injection 5 and 50 mg·kg-1groups. In the sensitization phase, the guinea pigs were ip administrered with breviscapine injection 0.5 mL each every other day for 3 times. The dose was 5 and 50 mg·kg-1, respectively. For the method of ″Pharmacopoeia″, on the 14th and 21st days after the first sensitization, the guinea pigs were iv administrered with breviscapine injection 1 mL. For the method of ″Guiding Principle″, the guinea pigs were provocated on the 12th day after the first sensitization. Each group was studied by observing the symptom of anaphylactic reaction and immune time. RESULTS For the method of ″Pharmacopoeia″, on the 14th day after the first sensitization, there was 1 guinea pig with sneezing and (or) the nose-scratching at different time in the 5 mg·kg-1group. In the 50 mg·kg-1group, there was one or two cases of sneezing and (or) 1 case of nose-scratching. The 5 and 50 mg·kg-1dose groups conformed to the regulations. On the 21st day after the first sensitization, trembling occurred in the 5 mg·kg-1group, with 1 or 2 guinea pigs sneezing and (or) scratching the nose. There were 4 guinea pigs (4/4) with sneezing 1 and 3 times, cough once or twice, 1 scratching nose and urination at different time, and 1 guinea pigs (1/4) appeared 3 times consecutive sneezing and shivering in 50 mg·kg-1group. The 5 mg·kg-1group conformed to the regulations, while the 50 mg·kg-1group did not. For the method of ″Guiding Principle″, the 5 mg·kg-1group was weak positive or positive, with different degrees of symptoms of an anaphylactic reaction, including 3 guinea pigs scratched nasal symptoms. And the 50 mg·kg-1group of anaphylactic symptoms including scratching nose, sneezing, coughing and (or) urination, showed positive. CONCLUSION During the active systemic anaphylactic reaction of drugs non-clinical safety evaluation of drugs the advantage of either method should be brought into play. The method of ″Pharmacopoeia″ may be used for preliminary screening of test samples. In case pf suspected reactions, the method of ″Guiding Principle″ should be used for more detailed observations.Key words: breviscapine injection; hypersensitivity; drug evaluation, preclinical

SUN Zu-yue, E-mail: sunzy64@163.com

上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(14140- 901302)

周 莉，女，研究員，主要從事藥物生殖藥理毒理學(xué)、前列腺疾病藥理毒理學(xué)的研究和新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)，E-mail: zhoulijss@163.com；孫祖越，男，博士，研究員，主要從事藥物生殖藥理毒理學(xué)、前列腺疾病藥理毒理學(xué)研究和新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)。

孫祖越, E-mail: sunzy64@163.com

Foundation item: The project supported by Shanghai ″Innovative Action Plan″ Experimental Animal Study (14140901302)

2014-06-22 接受日期: 2015-03-20)

R965.2

A

1000-3002(2015)02-0265-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.013

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