水溶性 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒的水熱合成及生物偶聯

2015-03-02 07:13:50孫振剛華瑞年

發光學報 2015年2期

肇欣，孫振剛，張偉，華瑞年*

(1.遼寧師范大學化學化工學院，遼寧大連 116029;2.大連民族學院生命科學學院，遼寧大連 116600)

1 引言

自從上世紀90年代以來，由于化學、物理和材料在納米領域的快速發展，導致了“納米科學和納米科技”這一新興學科的出現。作為21世紀的關鍵性技術，納米技術涉及到多學科交叉的研究領域。在這一領域中，尤其是高質量的單分散無機納米晶對形貌和比表面積的性質依賴，以及這一性質在光學、催化、生物傳感和數據存儲上的應用已經得到了極大的發展。稀土離子獨特的4f電子結構使稀土納米材料具有很多獨特的性質。稀土上轉換發光納米材料(Upconversion nanoparticles，UCNPs)已成為當前發光學領域的研究熱點［1-2］。

稀土摻雜氟化物上轉換納米發光材料具有毒性小、自熒光背景低、發射峰窄、化學性質穩定等特點，在紅外光光催化、光動力學治療、熒光探針和生物醫學等領域具有廣闊的應用前景［3-7］。傳統的熒光探針(如有機顏料)由于采用短波激發光源和相對較高的熒光漂白速率，因而具有較高的背景熒光并只能用于短時間內的成像［8］。與傳統發光標記物相比，UCNPs具有化學穩定性好、毒性低、發光強度高和Stokes位移大等優點。另外，UCNPs的激發光為紅外光，不會損傷生物體也不會激發出背景熒光，信噪比高，非常有利于活體生物成像［9-11］。NaYF4是近年來發現的一種理想的上轉換基質材料，具有較低的聲子能量，能降低多聲子弛豫率，提高上轉換發光效率，稀土氟化物β-NaYF4被公認為是一種優質的上轉換發光材料［12-14］。2010 年，喻學峰等［15］合成了一系列大半徑稀土離子(La3+、Ce3+、Pr3+、Nd3+、Sm3+、Eu3+和Gd3+等)摻雜的水溶性六方相NaYF4納米棒，六方相 NaYF4∶(Yb，Er)/La 和 NaYF4∶(Yb，Er)/Ce納米棒表現出比立方相更高的上轉換熒光效率。在目前報道的所有 UCNPs中，NaYF4∶Yb，Er/Tm的上轉換效率是最高的。可以用于生物檢測的上轉換熒光標記物也主要是 Yb/Er和Yb/Tm共摻雜的NaYF4納米粒子。NaYF4屬于多晶型的復合稀土氟化物，具有亞穩相——立方相(α-NaYF4)和穩定相——六方相(β-NaYF4)兩種晶體結構。六方相 NaYF4∶Yb，Er/Tm相對于其立方相材料，上轉換發光效率要高一個數量級。

本文利用一步水熱法合成出氨基表面修飾、單分散性好、尺寸小、發光性能優異的水溶性β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+上轉換納米棒，用X射線粉末衍射儀(XRD)、掃描電子顯微鏡 (SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)和熒光光譜(PL)等手段對制備的樣品進行了表征，并通過戊二醛法將BSA生物分子與所制備的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+上轉換納米棒成功偶聯。

2 實驗

2.1 試劑

分析純氯化鈉(NaCl)、無水乙醇(C2H5OH)、氟化銨(NH4F)、聚乙烯亞胺(PEI)、牛血清蛋白(BSA)、戊二醛(25%，質量分數)、磷酸(H3PO4)、考馬斯亮藍(G-250)、磷酸氫二鈉Na2HPO4·12H2O和磷酸二氫鈉 NaH2PO4·12H2O等均購于天津科密歐化學試劑有限公司。Y2O3(99.99%)、Gd2O3(99.99%)、Yb2O3(99.99%)和 Er2O3(99.99%)均購于上海第二化學試劑廠。氯化釓(GdCl3·6H2O)、氯化鐿(YbCl3·6H2O)、氯化釔(YCl3·6H2O)和氯化鉺 (ErCl3·6H2O)均為自制，即將相應的稀土氧化物溶于6 mol/L HCl中，重結晶4次獲得。

2.2 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒的制備

稱取0.058 4 g NaCl(1 mmol)、0.115 2 g YCl3·6H2O(0.38 mmol)、0.077 5 g YbCl3·6H2O(0.20 mmol)、0.007 63 g ErCl3·6H2O(0.02 mmol)和0.148 6 g GdCl3·6H2O(0.40 mmol)溶于10 mL去離子水中得到溶液A，再稱取0.296 0 g NH4F(8 mmol)溶于10.0 mL去離子水中得到溶液B，量取10mL質量濃度為0.05 g/mL的PEI溶液和30 mL無水乙醇混合在50 mL燒杯中得到溶液C。在不斷攪拌下，將溶液C緩慢滴加到溶液A中。攪拌30 min后，再將溶液B緩慢滴加到其中，10 min內完成滴加，再緩慢勻速攪拌20 min。將上述溶液倒入100 mL不銹鋼反應釜，放在烘箱中，溫度調至200℃，加熱8 h后，關閉烘箱，取出反應釜，自然冷卻至室溫。將產物在9 000 r/min的轉速下離心10 min，用無水乙醇洗滌4次，獲得的沉淀在80℃下干燥，得到的白色粉末即為表面有氨基修飾的水溶性β-NaY0.38Gd0.4F4∶20%Yb3+，2%Er3+納米棒。

2.3 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+與 BSA 偶聯產物的制備

準確稱取10 mg所制備的 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒溶解在2.0 mL去離子水中，超聲分散30 min后，在3 000 r/min的轉速下離心，上清液倒出以備后續實驗中使用。將有少量沉淀的離心管放入烘箱中，干燥后稱其質量，用于計算溶解于水中的樣品的質量。將1 mg的BSA加入到上清液中，在室溫下攪拌2 h后，再將0.10 mL戊二醛(25%，質量分數)滴加到上述溶液中，在室溫下緩慢攪拌5 h。將產物在9 000 r/min的轉速下離心，并用磷酸緩沖溶液(10 mmol/L，pH=7.4)洗滌3次，最后定容在2.0 m L的磷酸緩沖溶液中。

2.4 實驗儀器

日本島津公司產XRD-6000型X射線粉末衍射儀，銅靶(λ=0.154 06 nm);日本日立公司產S-4800型場發射掃描電子顯微鏡;日本電子公司JEM-2010型透射電子顯微鏡;日本Horiba公司產SZ-100-Z型激光粒度分析儀;日本日立公司F-4600型熒光光譜儀;日本島津UV-2450紫外光譜儀;上海美譜達儀器有限公司產UV-6100紫外-可見分光光度計。摩爾分數為40%條件下制得的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒樣品的粉末X射線衍射(XRD)譜。從圖中可以看出，β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒的衍射峰與β-NaYF4的標準卡片完全一致，沒有出現其他雜質峰，表明產物物相純凈、結晶良好。在該反應條件下，如果不引入大半徑的Gd3+，產物為 α-NaYF4和 β-NaYF4混相產物;隨著Gd3+離子摻雜量的增大(至Gd3+的摩爾分數到30%)，仍得不到純相的 β-NaYF4(產物為 β-NaYF4和少量的α-NaYF4)。該實驗結果表明，當引入一定量大半徑的Gd3+后，在較短的反應時間內，有利于α-NaYF4向β-NaYF4相轉變，并最終獲得純相的β-NaYF4納米棒。

3 結果與討論

3.1 物相結構分析

圖1為反應溫度200℃、反應時間8 h、Gd3+

圖1 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒的XRD譜Fig.1 XRD pattern ofβ-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+nanorods

3.2 形貌分析

在室溫下，通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡對合成的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒的形貌進行了觀測，如圖2所示。

從圖2可以看出，β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+樣品的形貌為規則的實心六棱柱型納米棒，截面粒徑平均約為40 nm，平均長度約為210 nm。偶聯BSA后的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+表面覆蓋了一層物質，因此形貌發生了變化，但粒徑大小沒有發生明顯改變。

3.3 熒光光譜分析

圖3是在980 nm激發下的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒的上轉換發光光譜。譜圖顯示了4個明顯的發射帶，發射中心位于407，529，546，660 nm，分別對應于2H9/2→4I15/2、2H11/2→4I15/2、4S3/2→4I15/2和4F9/2→4I15/2躍遷。圖 4 是 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒的上轉換發光機理圖。Er3+的基態能級是4I15/2，當用980 nm的紅外激光器激發樣品時，電子躍遷至4I11/2能級，Yb3+發生2F7/2→2F5/2躍遷，激發到2F5/2能級的電子通過聲子參與的非共振能量轉移把能量轉到Er3+的4I11/2能級上。Er3+可吸收第2個光子或吸收鄰近已處于2F5/2能級的電子的能量，再次躍遷至2H11/2和4S3/2能級，返回基態能級4I15/2時分別發出529 nm和546 nm的綠光;另有一部分到達4S3/2能級的電子經無輻射躍遷至4F9/2能級，由4F9/2能級返回基態時發出660 nm的紅光。

圖2 樣品 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+的SEM 照片(a)和透射電鏡照片(c)，β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+偶聯BSA后的SEM照片(b)及β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+的粒徑分析圖(d)。Fig.2 SEM image(a)and TEM image(c)ofβ-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+，SEM image(b)ofβ-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+conjugated with BSA，and particle size distribution ofβ-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+(d).

圖4 β-NaYF4∶Yb3+/Er3+的上轉換發光機理圖Fig.4 Upconversion luminescence mechanism diagram ofβ-NaYF4∶Yb3+/Er3+

圖3 樣品 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+的熒光譜 (λex=980 nm)Fig.3 Fluorescent spectrum ofβ-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+(λex=980 nm)

3.4 紫外光譜分析

作為有機功能分子，聚乙烯亞胺(PEI)被選作修飾β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒表面的有機功能分子。因PEI結構中含有氨基，并且可進一步與BSA偶聯。PEI修飾的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒能夠很好地分散在水溶液中(溶解度約為1 mg/mL)，其表面氨基的存在非常適合于生物和生物醫學應用。圖5的紫外-可見吸收光譜進一步證實了 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒樣品已與BSA成功偶聯。在BSA的紫外標準光譜中，位于276 nm和208 nm的峰被指認為BSA中的色氨酸殘基和肽鍵的吸收峰。在 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI-BSA 的紫外光譜中也可以觀察到276 nm和208 nm處的吸收峰，然而在 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI的紫外光譜中卻沒有出現這兩個吸收峰。這一實驗結果初步證實了BSA與β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI納米棒的成功偶聯。

3.5 考馬斯亮藍法定量分析蛋白含量

用布拉德福德試劑(100 mg的考馬斯亮藍G-250在50 mL的95%乙醇中溶解，然后加入120 mL的85%磷酸，用水稀釋至1.0 L)與BSA發生顏色反應，進一步定量地驗證 BSA是否與 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI納米棒偶聯?？捡R斯亮藍G-250是一種甲基取代的三苯基甲烷，分子中含磺酸基的藍色染料，在465 nm處有最大的吸收值。因此，布拉德福德試劑能吸收465 nm可見光，布拉德福德試劑與BSA蛋白結合物可以吸收595 nm可見光，其吸光度值與蛋白質含量成正比。這種變化通過紫外光譜分析法可以用來量化樣品中BSA蛋白的含量。

首先，配制BSA的標準溶液，濃度分別為0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL 的 BSA 溶液各1.00 mL。然后，向上面的BSA溶液中分別加入5.00 mL的布拉德福德試劑。2 min后，用布拉德福德試劑-BSA偶聯物的蛋白質溶液在595 nm處進行吸光度的測定，測定的值依次為0，0.145，0.294，0.403，0.565，0.652。最后得到在0.0 ～0.1 mg/mL濃度范圍內的吸光度與BSA的濃度的線性關系，如圖6所示?；貧w方程可以表示如下:

Y=6.6129X+0.0125，(R2=0.995 1)， (1)式中，X為BSA濃度，Y為吸光度。經測定，樣品β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI-BSA 的吸光度為0.127，根據蛋白質標準曲線計算出β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI表面的BSA偶聯率為1.73%(含BSA 0.017 3 mg/mL)。這個結果進一步表明，BSA 與 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI納米粒子偶聯成功。

圖6 在595 nm吸收波長下，BSA的濃度與吸光度的關系曲線。Fig.6 Linear relationship between the concentration of BSA and absorbance at595 nm

4 結論

以聚乙烯亞胺(PEI)為表面活性劑，采用水熱法，在Gd3+的摩爾分數為40%、反應溫度為200℃、時間為8 h的條件下制得了純相的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒。納米棒的平均截面粒徑約為40 nm，平均長度約為210 nm。偶聯BSA后的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+表面覆蓋了一層物質，因此形貌發生了變化，但粒徑大小沒有發生明顯改變。當用980 nm波長激發樣品后，β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒的上轉換光譜中出現了4個明顯的發射帶，發射中心位于 407，529，546，660 nm，分別對應于2H9/2→4I15/2、2H11/2→4I15/2、4S3/2→4I15/2和4F9/2→4I15/2躍遷。采用戊二醛法，使得蛋白(BSA)上的氨基與 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒表面的氨基牢固地鍵合在一起，并通過紫外光譜分析和考馬斯亮藍法證明了β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒與 BSA偶聯成功。根據考馬斯亮藍法算出 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒與 BSA的偶聯率為1.73%(0.017 3 mg/mL)。該研究為將 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒應用于生物分子分析、細胞標記及成像提供了實驗參考。

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