人巨細胞病毒pUL76蛋白非保守C端與蛋白聚集體形成的研究

張文昌，陳敬賢，2，王明麗

人巨細胞病毒pUL76蛋白非保守C端與蛋白聚集體形成的研究

張文昌1，陳敬賢1，2，王明麗1

摘要目的 通過分別構建人巨細胞病毒（HCMV）UL76基因編碼蛋白的全長以及保守N端和非保守C端的真核表達質粒，探討pUL76引起核內蛋白聚集體形成的決定序列。

方法 根據GenBank中HCMV AD169（FJ527563．1）株基因序列設計分別用于擴增pUL76全長以及保守N端和非保守C端的引物，將3段序列分別構建至增強型綠色熒光蛋白表達載體（pEGFP-N1）中，經雙酶切和測序驗證重組質粒的正確構建。空載體和3種重組質粒分別瞬時轉染人胚肺成纖維細胞（HELF）和人肝癌細胞（HepG-2），經逆轉錄（RTPCR）和Western blot法驗證各段基因的正確表達，在熒光顯微鏡下觀察轉染不同重組質粒后細胞核內蛋白聚集體形成的狀態。結果 pEGFP-N1空載體和pUL76保守N端均不能引起核內蛋白聚集體的形成，而pUL76及其非保守C端均能夠引起核內蛋白聚集體的形成。結論 pUL76非保守C端是其引起核內蛋白聚集體形成所必須的。

關鍵詞人巨細胞病毒；UL76；蛋白聚集體

2015－01－19接收

作者單位：1安徽醫科大學微生物學教研室，合肥 230032

2哥倫比亞大學病理與細胞生物學系，紐約 10032

皰疹病毒有著相似的結構和復制周期，有一些基因行使著相同或相近的功能，比如用于DNA合成的DNA聚合酶、轉錄調節因子等。現已知皰疹病毒家族的3個亞科中約有40個核心基因來自共同祖先［1］，且這些基因在3個亞科中都保守。通常將從共同祖先繼承而來，在不同亞科中的同源基因構成1個基因家族。皰疹病毒UL24基因家族即屬于這40個核心基因之一，其編碼的氨基酸序列N端高度保守，C端變異較大［2］。該基因家族在病毒整個復制周期以及潛伏感染中的作用研究較少。人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）屬于皰疹病毒β亞科，其UL76基因屬于皰疹病毒UL24基因家族。研究［3］表明UL76轉染細胞最顯著的特征是引起細胞核內蛋白聚集體的形成。該研究通過分別構建pUL76及其保守N端和非保守C端的真核表達質粒，確定了pUL76引起蛋白聚集體的決定序列。

1 材料與方法

1．1 實驗材料 HCMV AD169毒株由復旦大學醫學院微生物學教研室提供；人胚肺成纖維細胞（human embryonic lung fibroblast，HELF）和人肝癌細胞（human hepatoma，HepG-2）購自美國ATCC公司；HELF細胞、HepG-2細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養基（內含100 U／ml青霉素，100 g／ml鏈霉素）在37℃、5%CO2條件下培養。pEGFP-N1質粒購自美國Clontech公司；脂質體2000購自北京Invitrogen公司；T4 DNA連接酶、BamHⅠ和HindⅢ限制性內切酶和逆轉錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司；Rabbit-anti-GFP抗體、蛋白質提取試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；引物由北京Invitrogen公司合成。

1．2 方法

1．2．1 質粒構建 PCR分別擴增出HCMV UL76全長、UL76保守N端和UL76非保守C端的編碼序列。用于擴增各片段的PCR引物如下：UL76全長（325aa）F：5′-AAGCTTATGCCGTCCGGGCGT-3′，R：5′-GGATCCGCTAAAGACCGTGTGGGACGGCG-3′；

UL76N（1～190aa）F：5′-AAGCTTATGCCGTCCGGGCGT-3′，R：5′-GGATCCGCCCGTCCCAGATAGTC-3′；UL76C（187～325aa）F：5′-AAGCTTATGGACTATCTGGGACGGCG-3′，R：5′-GGATCCGCTAAAGACCGTGTGGGACGGCG-3′。各片段分別連接至pEGFP-N1真核表達載體，所形成的新的重組質粒分別命名為pEGFP-UL76、pEGFP-UL76N和pEGFP-UL76C。陽性克隆經雙酶切和測序鑒定后，保菌并提取適量質粒DNA用于轉染。

1．2．2 細胞轉染和熒光顯微鏡觀察 轉染前1 d HELF細胞1×106／ml（或HepG-2細胞2×105／ml）密度鋪于6孔板中。分別將2．5 μg質粒和5 μl脂質體2000混勻于500 μl無血清和抗生素的DMEM培養基中，室溫靜置5 min后將兩者輕輕混勻，室溫

放置20 min。在此過程中用PBS洗滌細胞3次，每次5 min。最后吸盡PBS，將1 ml混合液加到細胞中，37℃、5%CO2條件下培養24 h后換含有血清和抗生素的DMEM完全培養基，并于熒光顯微鏡下觀察。

1．2．3 逆轉錄PCR（RT-PCR） 轉染后48 h，用PBS洗滌細胞3次。6孔板每孔加入500 μl TRIzol試劑。RNA提取采用生工總RNA提取試劑盒（SK1322）。用于cDNA合成的RNA先用DNaseⅠ處理，然后由RevertAid First Strand cDNA Synthesis kits合成，每20 μl體系加1 μg模版RNA。RT-PCR所用引物同克隆引物。

1．2．4 Western blot法檢測 轉染后48 h，用PBS洗滌細胞3次。6孔板每孔加入150 μl蛋白裂解液（含PMSF 1 μmol／L），冰上裂解30 min，期間每隔10 min晃動平板使裂解液均勻覆蓋。收集裂解液于－80℃保存。然后采用BCA法進行蛋白質定量。SDS-PAGE分離目的蛋白，250 mA恒流轉膜80 min。轉印了蛋白的PVDF膜用3%的脫脂奶粉封閉1 h。Rabbit-anti-GFP一抗1∶600倍稀釋，孵育過夜。PBST洗滌3次后用HRP標記羊抗兔二抗（1 ∶5 000）孵育1 h，PBST洗滌3次后進行化學發光法曝光。

2 結果

2．1 PCR擴增UL76全長以及UL76保守N端和UL76非保守C端的編碼序列 采用梯度退火溫度摸索PCR擴增UL76、UL76保守N端（1～190aa）和非保守C端（187～325aa）3個不同片段的最適退火溫度。PCR擴增結果經1%瓊脂糖凝膠電泳。見圖1。

2．2 UL76、UL76N（1～190aa）、UL76C（187～325aa）連接至pEGFP-N1 雙酶切UL76、UL76N（1 ～190aa）、UL76C（187～325aa）連接至pEGFP-N1后轉化大腸桿菌DH5α，卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆，陽性克隆擴大培養并提取質粒經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切。見圖2。酶切結果顯示3種不同的片段都成功連接至真核表達載體pEGFP-N1上。

2．3 3種重組質粒測序結果與HCMV AD169株UL76基因比對 采用DNAMAN軟件對測序結果與GenBank中登錄的HCMV AD169株（FJ527563．1）UL76基因序列進行比對，散點圖中對角線兩側相同位置出現相應的散點，表明序列有一致性。縱坐標代表目的序列，從下至上方向為讀碼框方向；橫坐標代表3個重組質粒的測序結果，從左至右為讀碼框方向，A、B、C分別與目的序列全長、N端和C端序列相同。見圖3。

2．4 pUL76、pUL76保守N端和pUL76非保守C端亞細胞定位的不同以及引起蛋白聚集體形成的差異 將4種質粒分別轉染HepG-2細胞和HELF細胞。見圖4、5。轉染不同質粒后增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）可以很好的顯示目的片段在細胞內的定位，另外蛋白聚集體可以通過熒光信號聚集在細胞內形成斑塊樣結構

來體現，圖4 B、D中紅色箭頭箭頭所指為細胞核內蛋白聚集體的形成。

2．5 RT-PCR和Western blot法驗證各重組質粒的正確表達 因為目前沒有商品化的UL76抗體，但是各重組質粒表達的融合蛋白均含有EGFP-tag，所以本研究采用抗EGFP抗體來檢測各融合蛋白的表達。經蛋白質分子量預測，EGFP-tag按27 ku計算，各融合蛋白大小應為：pEGFP-N1為27 ku，pEGFP-UL76為63 ku，pEGFP-UL76N為49 ku，pEGFPUL76C為41 ku。見圖7。

3 討論

研究［2］表明皰疹病毒UL24家族成員都能夠引起細胞周期阻滯，生物信息學分析顯示該家族成員有潛在的核酸內切酶活性［4］。其他一些功能也在部分UL24家族成員中得到驗證，如HSV-1 UL24（皰疹病毒α亞科）與病毒毒力相關［5］，能引起核仁素的重新分布等［6-7］。皰疹病毒β亞科的HCMV UL76不僅能夠調節病毒自身基因（立即早期、早期以及晚期基因）的表達［8］，還能夠調節宿主基因的表達，如誘導IL-8的表達［9］；致染色體損傷［10］；引起核內蛋白聚集體的形成［3］等。皰疹病毒γ亞科如KSHV的ORF20目前研究較少。

細胞內一些異常的或不正確折疊的蛋白會給細

胞本身代謝帶來不利的影響，這些蛋白需要被及時識別和清理。在細胞質中，錯誤折疊的蛋白能夠通過兩種途徑被降解：泛素化降解途徑和溶酶體參與的自噬途徑。而在細胞核中錯誤折疊的蛋白只能夠通過泛素化降解途徑來清理［11］，當錯誤折疊蛋白產生過多以致超出它們的降解能力或蛋白酶體功能自身受損（如泛素化蛋白受體S5a被扣留）后，錯誤折疊蛋白會進一步形成蛋白聚集體。一些嚴重的神經系統疾病如克雅病就是與細胞內錯誤折疊的蛋白不能夠被清除，進而形成聚集體有關［12］。

研究［3］顯示，UL76可以通過與泛素化降解途徑受體S5a相互作用引起核內蛋白聚集體形成。本研究在重復其部分研究的過程中顯示，引起核內蛋白聚集體形成并非由其保守N端決定，而是由非保守的C端決定。由于所克隆的片段均相同，區別僅在本課題組采用的真核表達載體為pEGFP-N1，而Lin et al［3］使用的是pEGFP-C1（本實驗中目的基因位于EGFP N端，對方實驗中目的基因位于EGFP C端），因此產生了截然相反的結果。而且通過核定位信號預測也表明pUL76所含有的核定位信號（205～245aa）位于非保守C端，現有的實驗結果也證實只有pUL76和pUL76非保守C端定位于細胞核，而pUL76保守N端彌散分布于整個細胞。因此非保守的C端與細胞核內蛋白泛素化降解途徑受體S5a相互作用更符合實際。

HCMV先天性感染主要累及中樞神經系統，可引起感音神經性耳聾、智力發育遲緩和小頭畸形等。目前，HCMV致神經系統病變的確切機制尚不清楚。本研究通過截短表達UL76的不同片段，探討pUL76引起細胞核內蛋白聚集體形成的決定序列，從而為進一步研究UL76的生物學功能以及其在HCMV致病中所扮演的角色奠定基礎。

參考文獻

［1］ Davison A J．Evolution of the herpesviruses［J］．Vet Microbiol， 2002，86（1－2）：69－88．

［2］ Nascimento R，Dias J D，Parkhouse R M．The conserved UL24 family of human alpha，beta and gamma herpesviruses induces cell cycle arrest and inactivation of the cyclinB／cdc2 complex［J］．Arch Virol，2009，154（7）：1143－9．

［3］ Lin S R，Jiang M J，Wang H H，et al．Human cytomegalovirus UL76 elicits novel aggresome formation via interaction with S5a of ubiquitin proteasome system［J］．J Virol，2013，87（21）：11562 －78．

［4］ Knizewski L，Kinch L，Grishin N V，et al．Human herpesvirus 1 UL24 gene encodes a potential PD-（D／E）XK endonuclease［J］．J Virol，2006，80（5）：2575－7．

［5］ Jacobson J G，Martin S L，Coen D M．A conserved open reading frame that overlaps the herpes simplex virus thymidine kinase gene is important for viral growth in cell culture［J］．J Virol，1989，63 （4）：1839－43．

［6］ Bertrand L，Pearson A．The conserved N-terminal domain of herpes simplex virus 1 UL24 protein is sufficient to induce the spatial redistribution of nucleolin［J］．J Gen Virol，2008，89（Pt 5）：1142－51．

［7］ Bertrand L，Leiva-Torres G A，Hyjazie H，et al．Conserved residues in the UL24 protein of herpes simplex virus 1 are important for dispersal of the nucleolar protein nucleolin［J］．J Virol，2010，84（1）：109－18．

［8］ Wang S K，Duh C Y，Chang T T，et al．Cloning and identification of regulatory gene UL76 of human cytomegalovirus［J］．J Gen Virol，2000，81（Pt 10）：2407－16．

［9］ Costa H，Nascimento R，Sinclair J，et al．Human cytomegalovirus gene UL76 induces IL-8 expression through activation of the DNA damage response［J］．PLoS Pathog，2013，9（9）：e1003609．

［10］Siew V K，Duh C Y，Wang S K．Human cytomegalovirus UL76 induces chromosome aberrations［J］．J Biomed Sci，2009，16：107．

［11］Matsuo Y，Kishimoto H，Tanae K，et al．Nuclear protein quality is regulated by the ubiquitin-proteasome system through the activity of Ubc4 and San1 in fission yeast［J］．J Biol Chem，2011，286 （15）：13775－90．

［12］Lee J，Hyeon J W，Kim S Y，et al．Review：Laboratory diagnosis and surveillance of Creutzfeldt-Jakob disease［J］．J Med Virol，2015，87（1）：175－86．

Unconserved C terminal of pUL76 in human ctomegalovirus elicits aggresome formation

Zhang Wenchang1，Chen Jingxian1，2，Wang Mingli1
（1Dept of Microbiology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Pathology，Columbia University，New York 10032）

AbstractObjective To define the nuclear agrresome formation is determinated by which part of the UL76 of

HCMV．Full-length，conserved N terminal and unconserved C terminal of pUL76 were constructed to eukaryotic expression plasmid pEGFP-N1．Methods Primers were designed to amplify full-length and different part of pUL76 according to standard sequence of HCMV AD169 which had been submitted to GenBank（FJ527563．1）．These fragments were constructed to eukaryotic expression plasmid pEGFP-N1．The recombinant plasmids were designated pEGFP-UL76，pEGFP-UL76N，pEGFP-UL76C respectively．Double digestion and sequencing were performed to verify the accuracy of recombinant plasmids construction．Empty vector and three recombinant plasmids were transient transfected to HELF and HepG-2 cells respectively．Reverse transcriptation PCR and Western blot were performed to detect the RNA and protein expression level respectively．Different nuclear aggresome formations were visualized with an Olympus fluorescence microscopy．Results pEGFP-N1 and pEGFP-UL76N were unable to induce nuclear aggresome formation，whereas pEGFP-UL76 and pEGFP-UL76C were able to elicit nuclear aggresome formation．Conclusion The unconserved C terminal of pUL76 is sufficient to induce nuclear aggresome formation．

Key wordshuman cytomegalovirus；UL76；protein aggresome

作者簡介：張文昌，男，碩士研究生；王明麗，女，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：mingliwang＠ahmu．edu．cn

基金項目：國家自然科學基金（編號：30872253）；安徽高校省級自然科學研究項目（編號：KJ2012ZD08）

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0411－05

中圖分類號R 349．64