吉西他濱耐藥的胰腺癌SW1990細(xì)胞株的建立及相關(guān)特性檢測

賈一夫，丁 飛，余 躍，高 萌，楊顯珠，王 均

吉西他濱耐藥的胰腺癌SW1990細(xì)胞株的建立及相關(guān)特性檢測

賈一夫1，丁 飛1，余 躍1，高 萌1，楊顯珠2，王 均2

摘要目的 探討對吉西他濱（GEM）耐藥的胰腺癌SW1990細(xì)胞誘導(dǎo)方法，以期進(jìn)一步認(rèn)識胰腺癌耐藥的發(fā)生機(jī)制，并對誘導(dǎo)的GEM耐藥的胰腺癌細(xì)胞與其親本細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行比較。方法 采用逐步濃度遞增法誘導(dǎo)對GEM耐藥的細(xì)胞株SW1990-GZ。MTT法檢測SW1990和SW1990-GZ的半數(shù)致死量（IC50）、耐藥系數(shù)（R），并觀察其生長差異。采用高效液相色譜法（HPLC）檢測不同時(shí)間點(diǎn)SW1990和SW1990-GZ對GEM藥物的攝取情況。結(jié)果 SW1990和SW1990-GZ的IC50為（0.07±0.002 1）、（87.50± 3.240 0）μg／ml，R＝1 250；在不同濃度GEM作用下，誘導(dǎo)后耐藥的SW1990-GZ對GEM的敏感性明顯降低。細(xì)胞生長曲線顯示耐藥細(xì)胞SW1990-GZ相對于SW1990生長緩慢。不同時(shí)間點(diǎn)GEM孵育后，SW1990-GZ細(xì)胞對GEM藥物的攝取較SW1990細(xì)胞降低。結(jié)論 成功誘導(dǎo)了耐GEM藥物的SW1990-GZ細(xì)胞株，耐藥性能穩(wěn)定、明顯。SW1990-GZ細(xì)胞可能存在著一定的機(jī)制使得細(xì)胞攝取GEM降低。

關(guān)鍵詞人類胰腺癌細(xì)胞株；吉西他濱耐藥；建立

2015－01－27接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院消化內(nèi)科，合肥 230001

2中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家實(shí)驗(yàn)室，合肥 230027

胰腺癌是預(yù)后最差的人類實(shí)體瘤之一，其5年生存率不足5%［1］。大部分胰腺癌患者初診時(shí)已錯(cuò)過手術(shù)切除機(jī)會，對放療敏感性低，對化療藥物易產(chǎn)生耐藥性。吉西他濱（gemcitabine，GEM）是胰腺癌臨床一線治療用藥，相對于傳統(tǒng)化療藥物，其不僅提高了有效率，而且大大改善了患者的生活質(zhì)量。但隨著臨床上GEM耐藥性的出現(xiàn)，使得其藥效的發(fā)揮大打折扣［2］。因此，構(gòu)建耐GEM的胰腺癌細(xì)胞并研究耐藥機(jī)制是當(dāng)前胰腺癌防治最迫切的研究課題。該實(shí)驗(yàn)以人胰腺癌SW1990細(xì)胞為研究對象，構(gòu)建對GEM耐藥的胰腺癌細(xì)胞株，并對耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞的一些特性進(jìn)行檢測與比較。

1 材料與方法

1．1 藥物、試劑及細(xì)胞系株 人胰腺癌細(xì)胞株SW1990（中科院上海細(xì)胞庫）；GEM（法國Lilly公司）；RPMI-1640、胎牛血清（美國Gibco公司）；四氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（美國Sigma公司）。

1．2 方法

1．2．1 耐藥細(xì)胞SW1990-GZ的建立 耐藥細(xì)胞株SW1990-GZ為SW1990細(xì)胞株由GEM經(jīng)濃度遞增法逐步誘導(dǎo)獲得，簡述如下。不同濃度的GEM培養(yǎng)SW1990細(xì)胞1周后，觀察細(xì)胞死亡情況，篩選出SW1990細(xì)胞的半數(shù)致死量（median lethal dose，IC50）為0．07 μg／ml，加入GEM至終濃度為0.1 μg／ml，在培養(yǎng)箱內(nèi)共同培養(yǎng)48 h后，棄含藥培養(yǎng)液。此時(shí)，大部分細(xì)胞死亡，存活細(xì)胞緩慢生長；更換普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待存活細(xì)胞長滿培養(yǎng)箱后，進(jìn)入對數(shù)生長期后，傳代2次，在重復(fù)同一劑量的藥物培養(yǎng)；至較穩(wěn)定后在0．4 μg／ml的GEM中繼續(xù)培養(yǎng)，依此每次使藥物濃度4倍遞增，最終使藥物濃度達(dá)到400 μg／ml；如此反復(fù)遞增加藥，篩選存活細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)后，直至其對高濃度的GEM產(chǎn)生穩(wěn)定耐藥性，并且在無藥培養(yǎng)液中以及反復(fù)凍存后耐藥性依然保持穩(wěn)定，歷時(shí)10個(gè)月獲得對GEM藥物穩(wěn)定耐受的細(xì)胞株SW1990-GZ。培養(yǎng)SW1990-GZ經(jīng)歷多代傳代后可定期向培養(yǎng)基中加入4 μg／ml GEM以維持細(xì)胞耐藥性。

1．2．2 MTT法檢測SW1990和SW1990-GZ對GEM的敏感性 取對數(shù)生長期SW1990及SW1990-GZ細(xì)胞經(jīng)PBS清洗胰酶消化后進(jìn)行計(jì)數(shù)。取適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)液接種于96孔板，細(xì)胞密度為5 000／孔，每孔液體量100 μl／孔；置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)24 h后，去除每孔中舊培養(yǎng)液，并向

其中加入含不同濃度GEM的培養(yǎng)基繼續(xù)溫箱孵育72 h，棄去培養(yǎng)基；每孔加入以無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋的0．5 mg／ml的MTT 100 μl，37℃孵育4 h，棄上清液；每孔加入DMSO 150 μl溶解，室溫振蕩15 min，于490 nm處應(yīng)用自動酶標(biāo)儀檢測吸光度（optical delnsity，OD）值。每個(gè)藥物濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，以種細(xì)胞不加藥孔為對照組及以無細(xì)胞不加藥的孔為空白對照組。不同濃度GEM作用下計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）＝（加藥細(xì)胞OD值－空白對照OD值）／（對照細(xì)胞OD值－空白對照OD值）×100%。計(jì)算耐藥細(xì)胞系SW1990-GZ的耐藥系數(shù)（R）。R＝SW1990-GZ細(xì)胞的IC50／SW1990細(xì)胞的IC50。繪制劑量－細(xì)胞存活率曲線，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1．2．3 細(xì)胞生長曲線的繪制 取對數(shù)生長期的SW1990及SW1990-GZ細(xì)胞經(jīng)PBS清洗，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液后，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)后分別接種于24孔板，細(xì)胞密度5 000／孔，液體量500 μl／孔。置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)，于種板后第1天開始用MTT比色法進(jìn)行細(xì)胞生長檢測，即向每孔中加入MTT溶液500 μl孵育4 h后，向每孔加入DMSO，隨后進(jìn)行酶標(biāo)儀下490 nm 的OD值檢測。每天1計(jì)，共計(jì)數(shù)8 d，每種細(xì)胞每次計(jì)數(shù)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1．2．4 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測細(xì)胞攝取情況 取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行清洗消化后吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后取相應(yīng)量進(jìn)行24孔板接種，細(xì)胞密度1×105／孔，液體量0．5 ml／孔。恒溫培養(yǎng)箱孵育24 h后向每孔中加入含GEM的培養(yǎng)基0．5 ml，GEM濃度200 μg／ml。從加藥開始計(jì)時(shí)，分別設(shè)定2 h與4 h的細(xì)胞攝取時(shí)間，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)2個(gè)復(fù)孔，以不加藥的細(xì)胞孔為空白對照。到時(shí)間后吸去含藥培養(yǎng)基，并用PBS清洗3次，向每孔中加入1%SDS＋2%Triton的細(xì)胞裂解液進(jìn)行常溫下裂解以釋放藥物，該操作結(jié)束可進(jìn)行凍融促進(jìn)更進(jìn)一步裂解細(xì)胞。充分裂解后用0．5 ml甲醇萃取，渦旋震蕩充分，混勻萃取除蛋白及碎片，10 000 r／min離心10 min。取上清液棄沉淀，樣品旋干除去有機(jī)萃取劑。旋干后樣品定容到100 μl后進(jìn)行HPLC檢測。HPLC檢測參數(shù)：柱溫30℃，紫外檢測波長268 nm，流動相如下：醋酸銨（pH＝5.5，0.05 mol／L）：甲醇溶液＝85∶15。外標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算SW1990-GZ及SW1990細(xì)胞的萃取效率。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以±s表示；組間變量比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 SW1990-GZ細(xì)胞與親本細(xì)胞生物學(xué)特性的比較

2．1．1 檢測SW1990-GZ及SW1990對GEM藥物的敏感性 經(jīng)MTT試驗(yàn)顯示，在各個(gè)濃度的GEM的作用下，SW1990-GZ細(xì)胞相較于誘導(dǎo)耐藥前的SW1990細(xì)胞顯現(xiàn)出顯著GEM耐受性，即SW1990-GZ細(xì)胞對GEM的敏感性急劇下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝6.562，P＜0.01）。SW1990與SW1990-GZ關(guān)于GEM的IC50值為（0.07±0.002 1）、（87.50 ±3.240 0）μg／ml，R＝1 250。SW1990-GZ和SW1990細(xì)胞的藥物濃度－細(xì)胞存活率曲線見圖1。

2．1．2 SW1990-GZ與SW1990生長趨勢的檢測最終繪制的生長天數(shù)－MTT OD值曲線見圖2，表明與SW1990細(xì)胞相比，SW1990-GZ細(xì)胞系生長增殖較緩慢（t＝3.611，P＜0.05）。

2．2 HPLC檢測SW1990-GZ與SW1990細(xì)胞對GEM藥物的攝取情況 實(shí)驗(yàn)中，SW1990-GZ細(xì)胞的萃取效率為80.26%，SW1990系的萃取效率為83.12%。在攝取2 h后經(jīng)HPLC檢測，SW1990細(xì)胞與誘導(dǎo)耐藥后的SW1990-GZ細(xì)胞比較，胞內(nèi)藥物濃度顯著增高（t＝7.047，P＜0.05）；4h后，SW1990

細(xì)胞胞內(nèi)藥物濃度仍高于SW1990-GZ細(xì)胞（t＝14.81，P＜0.01）。見圖3。

3 討論

構(gòu)建腫瘤耐藥的癌細(xì)胞系方法有多種，如基因轉(zhuǎn)染法、藥物誘導(dǎo)篩選法等［3］。本實(shí)驗(yàn)采取GEM藥物濃度間歇遞增的方法對原本不耐受GEM的親本SW1990細(xì)胞進(jìn)行長期誘導(dǎo)，最終經(jīng)過10個(gè)月才成功構(gòu)建對GEM耐藥SW1990-GZ細(xì)胞株。在進(jìn)行誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥的過程中，有以下問題需要注意：①先需對親本細(xì)胞進(jìn)行最基本的GEM藥物敏感性的檢測以獲得IC50，然后根據(jù)此濃度，篩選出一個(gè)適宜的初始濃度，再進(jìn)行細(xì)胞耐藥性誘導(dǎo)；②在加大劑量進(jìn)行下一步誘導(dǎo)前，需將細(xì)胞培養(yǎng)基換成不含GEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長穩(wěn)定，否則持續(xù)讓細(xì)胞處于不同藥物濃度更換下，其細(xì)胞狀態(tài)沒有恢復(fù)到最佳，容易導(dǎo)致誘導(dǎo)試驗(yàn)的失敗；③強(qiáng)調(diào)GEM藥物濃度梯度合適，間歇遞增的梯度過大或過小均不利于穩(wěn)定耐藥性的獲得；④耐藥細(xì)胞的建立過程，關(guān)鍵是要有基本的細(xì)胞培養(yǎng)學(xué)知識與技術(shù)，在培養(yǎng)過程中要小心謹(jǐn)慎，防止細(xì)胞培養(yǎng)操作過程中的細(xì)胞污染而造成細(xì)胞死亡。本研究經(jīng)過MTT法檢測細(xì)胞對GEM的敏感性及HPLC檢測細(xì)胞對GEM的攝取，證實(shí)誘導(dǎo)耐藥的SW1990-GZ細(xì)胞株有良好的耐藥特性且耐藥性穩(wěn)定明顯，這使得該耐藥細(xì)胞株有望成為后期實(shí)驗(yàn)探討GEM耐藥機(jī)理及如何攻克細(xì)胞耐藥的理想細(xì)胞模型。間歇濃度梯度遞增法在給藥時(shí)間上類似于臨床胰腺癌化療的時(shí)間周期，故通過此法得到的研究結(jié)果可能對臨床更有指導(dǎo)意義。

本研究通過觀察耐GEM的SW1990-GZ細(xì)胞與親本細(xì)胞SW1990生長情況，發(fā)現(xiàn)前者的生長速度明顯較后者緩慢。導(dǎo)致這種現(xiàn)象出現(xiàn)的機(jī)制，從GEM藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制考慮，GEM是通過參與細(xì)胞DNA合成過程來達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的。在誘導(dǎo)GEM耐藥的過程中，用GEM間歇地處理生長期細(xì)胞，使處于DNA合成活躍的增殖期細(xì)胞更早受到抑制影響；不斷地進(jìn)行這樣一種篩選，生長增殖緩慢對GEM敏感性差的胰腺癌細(xì)胞就被遺留下來，組成了耐GEM的胰腺癌細(xì)胞株。研究［4］表明，腫瘤是由異構(gòu)的細(xì)胞群與腫瘤干細(xì)胞的一個(gè)小子集（兩者）維持腫瘤的形成和生長。研究［5］報(bào)道，化療藥物雖然能夠殺傷大部分的腫瘤細(xì)胞，但腫瘤干細(xì)胞存留下來，沒有被藥物殺傷，這可能是化療藥物導(dǎo)致腫瘤耐藥的重要機(jī)制之一。親本細(xì)胞經(jīng)GEM藥物誘導(dǎo)耐藥后，推測由于化療藥物的長期誘導(dǎo)殺傷致大部分腫瘤細(xì)胞死亡，而處于化療藥物不敏感的腫瘤干細(xì)胞能在此過程中生存下來成為耐藥細(xì)胞系的主生力量。研究［6］表明腫瘤干細(xì)胞長期處于休眠狀態(tài)或者生長增殖緩慢狀態(tài)。本研究中GEM耐藥細(xì)胞SW1990-GZ較親本細(xì)胞SW1990的生長速度慢，推測間歇遞增濃度的GEM可能起到一種篩選作用，同時(shí)對化療藥物不敏感的腫瘤干細(xì)胞可能參與了此過程。

本實(shí)驗(yàn)顯示SW1990-GZ細(xì)胞較其親本細(xì)胞胞內(nèi)的GEM藥物濃度明顯減少。該種耐藥細(xì)胞有可

能存在某種缺陷使得其對GEM藥物的攝取障礙，或者攝取GEM后，該種耐藥細(xì)胞可能存在某種機(jī)制使得攝取進(jìn)入細(xì)胞的GEM被快速的外排出胞；上述兩種現(xiàn)象最終都可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的GEM濃度減少，從而影響了藥物的抗腫瘤效應(yīng)，產(chǎn)生了腫瘤細(xì)胞耐藥性。

GEM是一種前藥，需要核苷酸引入細(xì)胞內(nèi)，減少平衡核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（human equilibrative nucleoside transporter，hENT1）的表達(dá)將阻斷細(xì)胞對GEM的攝取，從而賦予GEM對細(xì)胞的低毒性作用。有研究［6］表明，腫瘤細(xì)胞內(nèi)hENT1低表達(dá)的胰腺癌患者很少能從GEM的治療中獲益。Tanaka et al［6］分析了149例局部晚期胰腺癌的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因多態(tài)性，結(jié)果hENT1低表達(dá)不僅與GEM化療的Ⅲ、Ⅳ度粒細(xì)胞減少相關(guān)（P＝0.17），而且與不佳預(yù)后有關(guān)（無進(jìn)展生存期4.2個(gè)月vs 8.3個(gè)月）。本實(shí)驗(yàn)中SW1990-GZ細(xì)胞胞內(nèi)的GEM攝取明顯減少，推測可能與hENT1低表達(dá)有關(guān)。從這方面研究細(xì)胞耐藥的機(jī)制，有可能糾正藥物攝取缺陷，促進(jìn)對細(xì)胞的藥物耐受性攻克，為今后更有效的治療胰腺癌提供一條新途徑。

本實(shí)驗(yàn)成功誘導(dǎo)了GEM耐受的胰腺癌細(xì)胞株，耐藥性能明顯穩(wěn)定，為進(jìn)一步研究GEM耐藥機(jī)制提供了有效的細(xì)胞模型。

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Establishment of the human resistant pancreatic cancer cell lines SW1990／gemcitabine and its characteristics test

Jia Yifu，Ding Fei，Yu Yue，et al
（Dept of Gastroenterology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

AbstractObjective To investigate how to induce the resistant cell line SW1990／gemcitabine（GEM）for further clarify the resistant mechanisms of pancreatic cancer，and compare the characteristics between SW1990 and SW1990-GZ．Methods SW1990-GZ was derived from the human pancreatic cancer cell lines SW1990 by exposing the cells to intermittently increasing concentrations of GEM．The IC50，resistance index（R），and growth difference was observed by MTT assay．Cellular intake of SW1990 and SW1990-GZ was detection by HPLC．Results The IC50of SW1990 and SW1990-GZ were respectively（0.07±0.002 1）μg／ml，（87.50±3.240 0）μg／ml，R＝1 250；sensibility to GEM in SW1990-GZ were more lower than that in SW1990 cell in different concentration s of GEM．Growth rate of SW1990-GZ was slower than that of SW1990 from the growth curve；GEM intake in SW1990-GZ was lower than that in SW1990 in different times．Conclusion Human resistant pancreatic cancer cell lines SW1990／GEM is successfully established，and its resistant characteristics are stable and clear．SW1990-GZ maybe decrease GEM intake by some unclear pathways．

Key wordshuman pancreatic cancer cell lines；gemcitabine resistance；establish

作者簡介：賈一夫，男，碩士研究生；余 躍，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：yuyuemd＠163．com；王 均，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：jwang699＠ustc．edu．cn

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金（編號：1208085MH174）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0419－04

中圖分類號R 735．9