環巴胺對佐劑性關節炎大鼠關節軟骨細胞增殖凋亡的影響及其抗凋亡機制

丁 婧，李 榮，胡向陽，蔡 莉，張曉亮，汪 巧

環巴胺對佐劑性關節炎大鼠關節軟骨細胞增殖凋亡的影響及其抗凋亡機制

丁 婧1，李 榮2，胡向陽1，蔡 莉1，張曉亮3，汪 巧1

摘要目的 研究Hedgehog（Hh）信號通路阻斷劑環巴胺對佐劑性關節炎（AIA）大鼠關節軟骨細胞增殖凋亡的影響及抗凋亡機制。方法 弗氏完全佐劑誘導AIA大鼠模型，胰酶－膠原酶法分離培養關節軟骨細胞，環巴胺體外給藥處理AIA軟骨細胞，MTT法檢測細胞增殖，DNA電泳、Hoechst染色、Annexin V-FITC／PI雙染檢測細胞凋亡，RT-PCR檢測Shh、Gli1、Ptch1、Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表達。結果 環巴胺（0．08、0．4、2、10、50 μmol／L）劑量依賴性地提高AIA軟骨細胞增殖。AIA組可見凋亡細胞DNA梯狀條帶，環巴胺（0．4、2、10 μmol／L）給藥組的梯狀條帶明顯減少；AIA組存在核碎裂與染色質固縮，環巴胺給藥組均勻藍色熒光的細胞數量增多；流式分析結果表明AIA軟骨細胞凋亡率顯著升高，環巴胺明顯減少細胞凋亡率；與正常組相比，AIA組軟骨細胞中Hh信號通路相關基因（Shh、Ptch1、Gli1）mRNA表達顯著升高，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達顯著下降，而促凋亡基因Bax、Caspase-3 mRNA表達明顯升高。環巴胺體外給藥能抑制Hh信號通路過度活化，提高Bcl-2 mRNA表達，并降低Bax、Caspase-3 mRNA表達。結論 環巴胺體外給藥能促進AIA軟骨細胞的增殖，并抑制AIA軟骨細胞的過度凋亡；該抗凋亡作用和調節Bcl-2、Bax和Caspase-3表達密切相關，提示干預軟骨細胞Hh信號通路對保護類風濕關節炎關節軟骨具有潛在的治療意義。

關鍵詞Hedgehog信號通路；環巴胺；佐劑性關節炎；關節軟骨細胞；增殖；凋亡

2014－12－13接收

作者單位：安徽醫科大學1病理學教研室、2藥學院，合肥 230032

3安徽省立醫院病理科，合肥 230032

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性炎癥性疾病，以滑膜慢性炎癥為特點，最終導致關節軟骨及周圍組織的破壞［1］。軟骨損傷與RA嚴重程度和預后密切相關，保護軟骨功能、遏止軟骨破壞，能阻逆RA病理進程、降低RA致殘率［2－3］。既往Hedgehog（Hh）信號通路的研究［4－5］集中在胚胎期組織分化發育調節及腫瘤形成機制，該通路在軟骨細胞的增殖和分化、骨形成與骨代謝等生理和病理過程中亦發揮復雜調控作用。研究［6－7］表明Hh信號通路在骨關節炎（osteoarthritis，OA）關節軟骨中異常激活，與OA軟骨破壞程度密切相關，抑制該通路能明顯緩解病情。RA與OA具有相似的軟骨病理變化和臨床癥狀，抑制Hh信號通路能否用于RA治療的類似研究至今未見報道。佐劑性關節炎（adjuvant-induced arthritis，AIA）的病理過程和實驗室指標與RA相似，是研究RA發病機制和篩選RA治療藥物的經典動物模型。該研究以AIA大鼠關節軟骨細胞為研究對象，探討Hh信號通路阻斷劑環巴胺體外給藥對其增殖凋亡的影響及可能機制，為防治RA尤其是保護RA關節軟骨提供新的思路。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 SD大鼠，清潔級，雄性，180～200 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供；自由攝食和飲水，適應性飼養1周后使用。

1．2 藥物與試劑 環巴胺（美國LC實驗室）；弗氏完全佐劑（美國Chondrex公司）；MTT細胞增殖檢測試劑盒、DNA抽提試劑盒、Hoechst 33342染色液（上海碧云天生物技術研究所）；AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物公司）；TRIzol（美國Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒（立陶宛Fermentas公司）；PCR試劑盒（美國Promege公司）；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

參考文獻1．3 大鼠AIA模型制備［8］方法，右后足趾皮內注射0．1 ml弗氏完全佐劑致炎作為AIA大鼠，注射同體積的生理鹽水作為正常大鼠。 1．4 胰酶－膠原酶法分離培養大鼠關節軟骨細胞及鑒定［9］方法，分離大鼠關節表面軟骨，37℃胰酶和0.2%Ⅱ型膠原酶分別消化40 min 和3 h。200目濾網過濾收集消化液，1 500 r／min離心10 min，PBS清洗，共3次。收集細胞，加入含

10%胎牛血清的DMEM培養液，吹打均勻后移入25 cm2培養瓶，培養48 h后換液除去未貼壁細胞，當原代培養的細胞連成片時進行傳代培養。本實驗中所用細胞為傳1～3代的關節軟骨細胞，并采用Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色和甲苯胺藍染色進行鑒定。

1．5 MTT法檢測關節軟骨細胞的增殖反應 收集對數增殖期的AIA軟骨細胞制成單細胞懸液，以2 ×108／L的細胞密度接種于96孔板，分7組：正常組（正常大鼠關節軟骨細胞）、AIA組（AIA大鼠關節軟骨細胞未給予藥物刺激）、環巴胺0.08、0.4、2、10、50 μmol／L給藥組（AIA大鼠關節軟骨細胞加入5組不同濃度的環巴胺）。每孔100 μl，37℃、5% CO2培養48 h，棄培養液，加入不含血清的DMEM培養液培養12 h，棄培養液，各給藥組再加入含不同濃度環巴胺（0.08、0.4、2、10、50 μmol／L）的完全DMEM培養液培養44 h，7組均加入MTT（5 g／L）10 μl／孔，孵育4 h，加入Formanzan溶解液100 μl／孔，光學顯微鏡下觀察Formanzan全部溶解后，用酶標儀在570 nm測定吸光度（absorbance，A）值A570。

1．6 DNA瓊脂糖凝膠電泳觀察關節軟骨細胞凋亡AIA關節軟骨細胞以2×108／L的密度接種于24孔板，分4組：AIA組、環巴胺0.4、2、10 μmol／L給藥組。每孔1 ml，培養48 h后棄培養液，加入含不同濃度環巴胺（0.4、2、10 μmol／L）的完全DMEM培養液繼續培養48 h，胰酶消化后將細胞轉入離心管，1 500 r／min離心10 min，收集細胞。按試劑盒說明書操作進行DNA抽提后取5 μl DNA在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，凝膠成像觀察并拍照。

1．7 Hoechst 33342染色觀察關節軟骨細胞凋亡AIA關節軟骨細胞以2×108／L的密度接種于6孔板（孔內預置消毒過的蓋玻片），分5組：正常組、AIA組、環巴胺0.4、2、10 μmol／L給藥組。每孔2 ml，培養48 h后棄去培養液，加入含不同濃度環巴胺（0.4、2、10 μmol／L）的完全DMEM培養液繼續培養48 h。PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX通透，PBS洗滌，滴加入終濃度為10 mg／L的Hoechst 33342避光染色20 min，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1．8 Annexin V-FITC／PI雙染法檢測關節軟骨細胞凋亡率 按1．7項進行細胞分組和藥物處理，吸取上清液至離心管，貼壁細胞用PBS洗滌，胰酶消化后將細胞轉入相應離心管，1 500 r／min離心10 min，收集細胞。PBS洗滌后加入400 μl Annexin V結合液懸浮細胞，再加入5 μl Annexin V-FITC染色液，4℃避光孵育15 min，再加入10 μl PI染色液4℃孵育5 min，上流式細胞儀檢測，采用WinMDI軟件進行結果分析。

1．9 RT-PCR檢測關節軟骨細胞中Shh、Gli1、Ptch1、Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表達 按1．7項進行細胞分組和藥物處理，采用TRIzol法提取細胞總RNA，按Fermentas試劑盒說明書進行逆轉錄。引物序列及退火溫度（Tm）如表1所示。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性60 s，退火60 s，72℃延伸60 s，35個循環；72℃延伸10 min。PCR產物在1．5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，通過光密度掃描，凝膠成像拍照并用Labworks軟件測定條帶灰度值。

表1　引物序列

1．10 統計學處理 采用SPSS 13．0軟件進行分析，數據以±s表示；組間比較采用One-Way ANOVA檢驗。

2 結果

2．1 大鼠關節軟骨細胞的培養和鑒定 光學顯微鏡下傳1代的大鼠關節軟骨細胞形態以梭形為主，胞質豐富，核為圓形或橢圓形，細胞周圍可見具有折光性的細胞外基質（圖1A）。免疫組化染色結果顯示大鼠軟骨細胞胞質被染成棕色，細胞生長越密集的地方染色越深，說明培養的關節軟骨細胞中有Ⅱ型膠原表達，證實本實驗培養的細胞為關節軟骨細胞（圖1B）。甲苯胺藍染色結果顯示大鼠軟骨細胞胞質被染成淺藍色，胞核被染成深藍色，可見有的軟骨細胞為雙核（圖1C）。

2．2 環巴胺對AIA關節軟骨細胞增殖反應的影響

MTT法檢測體外給予環巴胺（0.08、0.4、2、10、50 μmol／L）48 h后對AIA關節軟骨細胞增殖的影響。AIA組軟骨細胞的增殖明顯低于正常組（F＝12.09，P＜0.01）。環巴胺體外給藥能劑量依賴性地提高AIA關節軟骨細胞增殖，其中2、10、50 μmol／L差異有統計學意義（F＝12.09，P＜0.05，P ＜0.01）。見圖2。考慮到0.08 μmol／L作用不顯著，10、50 μmol／L兩個環巴胺濃度作用相當，故取0.4、2、10 μmol／L 3個濃度進行下一步研究。

2．3 DNA電泳觀察環巴胺抑制AIA關節軟骨細胞凋亡 AIA關節軟骨細胞可見清晰、典型的凋亡細胞DNA梯狀條帶，環巴胺0.4、2、10 μmol／L給藥組的DNA梯狀條帶均有不同程度地減少，提示AIA軟骨細胞存在明顯的細胞凋亡，而環巴胺處理能夠有效減少軟骨細胞凋亡。見圖3。

2．4 Hoechst 33342染色觀察環巴胺抑制AIA關節軟骨細胞凋亡 各組細胞經Hoechst染色后，熒光顯微鏡下可見正常組關節軟骨細胞的細胞核多數呈均勻的藍色熒光（圖4A），AIA組細胞存在核碎裂與染色質固縮，表現出凋亡形態學改變（圖4B），表明與正常軟骨細胞相比，AIA關節軟骨細胞存在異常凋亡過程。環巴胺給藥組呈現較少的凋亡細胞形態學改變（圖4C～E），提示環巴胺對AIA關節軟骨細胞起抗凋亡作用。

2．5 Annexin V-PI雙染檢測環巴胺抑制AIA關節

軟骨細胞凋亡 在雙變量散點圖上，FITC－／PI＋（Q1象限）表示死細胞，FITC＋／PI＋（Q2象限）表示中晚期凋亡細胞，FITC－／PI－（Q3象限）表示活細胞，FITC＋／PI－（Q4象限）表示早期凋亡細胞，Q2和Q4象限的細胞占全部細胞的比例代表細胞凋亡率（%）。定量分析結果顯示，與正常組相比，AIA組凋亡率明顯增高（F＝7.665，P＜0.01）；環巴胺（0.4、2、10 μmol／L）能劑量依賴性地減少AIA關節軟骨細胞的凋亡率，其中2、10 μmol／L差異有統計學意義（F＝7.665，P＜0.05，P＜0.01）。見圖5。

2．6 環巴胺對AIA關節軟骨細胞Hh信號通路與凋亡相關基因mRNA表達的影響 PCR擴增后所獲目的基因、β-actin的產物均與預期一致，典型的電泳圖片（圖6A、B）。半定量分析結果表明：與正常組相比，AIA組關節軟骨細胞中Hh信號通路相關基因（Shh、Ptch1、Gli1）mRNA表達顯著升高（F＝16.61、8.30、22.11，P＜0.01），表明AIA關節軟骨細胞Hh信號通路明顯活化，環巴胺體外給藥能降低AIA關節軟骨細胞上述基因的表達，抑制Hh通路的過度活化；同時，AIA關節軟骨細胞中抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達顯著下降（F＝22.16，P＜0.01），而促凋亡基因Bax和Caspase-3 mRNA的表達明顯升高（F＝3.376、3.147，P＜0.05，P＜0.01），環巴胺體外給藥能夠提高Bcl-2 mRNA表達，并降低Bax和Caspase-3 mRNA表達，這可能與其抗AIA關節軟骨細胞凋亡的作用密切相關。

3 討論

關節軟骨細胞是關節軟骨中的唯一細胞類型，參與調節關節軟骨的損傷及重塑過程，維持軟骨組

織乃至關節的內環境穩定，其功能異常在RA致殘的病理進程中起著病變節點的關鍵介導作用［10］。RA患者關節軟骨細胞存在過度凋亡，抑制其過度凋亡對RA骨損傷和骨侵蝕有保護意義［11－12］。研究［4－5］證實Hh信號通路通過甲狀旁腺素相關肽負反饋調節和Hh直接作用的雙重模式影響關節軟骨細胞的生物學行為，為此，本研究建立AIA大鼠模型，分離培養關節軟骨細胞，以Hh信號通路阻斷劑環巴胺作為實驗藥物，觀察體外干預AIA關節軟骨細胞Hh信號通路對細胞增殖和凋亡的影響及其可能機制。

本研究采用MTT法觀察了環巴胺體外給藥對AIA關節軟骨細胞增殖的影響，結果顯示環巴胺（0.08、0.4、2、10、50 μmol／L）體外給藥能劑量依賴性地提高AIA關節軟骨細胞增殖，提示環巴胺對AIA關節軟骨細胞的增殖有明顯的促進作用。DNA電泳是檢測凋亡發生時DNA片段或多聚體組成的寡核苷酸片段的標準方法，其典型結果是“梯狀帶”。AIA關節軟骨細胞可見典型的DNA梯狀條帶，環巴胺（0.4、2、10 μmol／L）體外作用48 h后的梯狀條帶明顯減少，大多僅見離點樣孔不遠的基因組DNA，以環巴胺2 μmol／L最明顯。Hoechst 33342為特異性DNA染料，采用熒光顯微鏡觀察細胞核染色質的形態學改變評判細胞凋亡情況。本實驗中正常組細胞呈均質藍色熒光，而AIA關節軟骨細胞皺縮明顯，細胞核呈不同程度的致密濃染或碎塊狀，染色質固縮、聚集，存在細胞凋亡的典型形態學改變；環巴胺給藥組的均勻藍色熒光的細胞數量增多，凋亡細胞數相對減少。采用Annexin-V FITC／PI雙染法進一步檢測了環巴胺對AIA關節軟骨細胞的抗凋亡作用，結果表明AIA關節軟骨細胞的凋亡率與正常組相比顯著增高，環巴胺（0.4、2、10 μmol／L）能劑量依賴性地減少AIA關節軟骨細胞的凋亡細胞率。上述結果均提示AIA關節軟骨細胞存在明顯的細胞凋亡過程，而環巴胺體外給藥能有效抑制其過度凋亡。

哺乳動物的Hh信號通路包括4個部分：Hh蛋白、跨膜受體Ptch和Smo、核轉錄因子Glis、下游靶基因［13］。RT-PCR結果表明AIA關節軟骨細胞中Shh、Ptch1、Gli1 mRNA的水平均較正常組顯著升高，表明Hh信號通路存在異常激活或傳導異常，環巴胺體外給藥能明顯降低上述基因的表達水平，有效抑制該通路過度活化，這可能與環巴胺促進AIA關節軟骨細胞增殖、抑制其過度凋亡密切相關。

細胞凋亡是由多種基因參與的復雜網絡系統，與細胞增殖和癌變有關的癌基因和抑癌基因都參與了對凋亡的調控。Bcl-2基因家族中的Bcl-2和Bax基因與細胞凋亡的關系倍受關注，其中Bax促進細胞凋亡，而Bcl-2能延長細胞生存，抑制細胞凋亡［14］。Caspase-3是各條凋亡通路作用的樞紐，是細胞凋亡的執行者，可導致細胞結構的全面解體，抑制Caspase-3酶活性或拮抗Caspase-3功能可使細胞凋亡受抑制［15］。有文獻［11］證實，RA關節軟骨組織中Bcl-2蛋白表達明顯降低，密切參與RA關節軟骨的異常凋亡過程。與其一致，本實驗結果表明，AIA關節軟骨細胞中Bcl-2 mRNA表達顯著下降，而Bax 和Caspase-3 mRNA表達明顯升高，環巴胺體外給藥能上調Bcl-2 mRNA表達，抑制Bax和Caspase-3 mRNA表達，進而發揮其抗凋亡作用。

綜上所述，Hh信號通路阻斷劑環巴胺體外能促進AIA關節軟骨細胞的增殖，并抑制其過度凋亡，該抗凋亡作用和調節Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達密切相關，提示干預關節軟骨細胞Hh信號通路對保護RA關節軟骨具有潛在的治療意義。

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Effects of cyclopamine on the proliferation and apoptosis of chondrocytes in adjuvant-induced arthritis rats and its anti-apoptotic mechanisms

Ding Jing1，Li Rong2，Hu Xiangyang1，et al
（1Dept of Pathology，2College of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032）

AbstractObjective To explore the effects of cyclopamine，a hedgehog（Hh）signal pathway inhibitor，on the proliferation and apoptosis of articular chondrocytes in adjuvant-induced arthritis（AIA）rats and its anti-apoptotic mechanisms．Methods Freund’s complete adjuvant was used to induce AIA．Articular chondrocytes were isolated and cultured by trypsin and collagenase digestion method．AIA articular chondrocytes were treated by cyclopamine in vitro．The cell proliferation was detected by MTT assay．The cell apoptosis was evaluated with DNA agarose gel electrophoresis，hoechst staining and flow cytometry analysis．The levels of Shh，Ptch1，Gli1，Bcl-2，Bax and Caspase-3 mRNA were detected by RT-PCR．Results Cyclopamine（0.08，0.4，2，10，50 μmol／L）could increase AIA articular chondrocytes proliferation in a dose-dependent．DNA ladder pattern was formed typically in AIA articular chondrocytes，while cyclopamine（0.4，2，10 μmol／L）treatment could reduce the formation of DNA ladder．AIA articular chondrocytes displayed nuclei fragmentation with condensed chromatin and cyclopamine could promote the number of uniform blue fluorescent cells．Flow cytometry analysis also indicated cyclopamine could visibly reduce the rate of apoptotic cells in AIA articular chondrocytes．Compared with normal group，the levels of Hh pathway-related genes（Shh，Ptch-1 and Gli1）mRNA apparently increased in AIA articular chondrocytes．Antiapoptotic gene Bcl-2 mRNA level significantly decreased，while pro-apoptotic genes Bax and Caspase-3 mRNA levels were significantly increased．Cyclopamine treatment could inhibit the excessive activation of Hh pathway，upregulate Bcl-2 mRNA expression，and reduce Bax and Caspase-3 mRNA expressions．Conclusion Cyclopamine could promote the proliferation and inhibit excessive apoptosis of AIA articular chondrocytes，which might be related to regulation of Bcl-2，Bax，and Caspase-3 expressions．Our results suggest that intervention of Hh signal in articular chondrocytes has potential therapeutic significance for articular cartilage protection in rheumatoid arthritis．

Key wordshedgehog signal pathway；cyclopamine；adjuvant-induced arthritis；articular chondrocytes；proliferation；apoptosis

作者簡介：丁 婧，女，碩士研究生；胡向陽，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：yfhxy2013＠163．com

基金項目：國家自然科學基金（編號：81102273）；教育部博士學科點專項科研基金（編號：20113420120005）

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0446－06

中圖分類號R 593．22；R 967