Treg和淋巴細胞亞群在急性髓系白血病中的意義

孔令君，葛 健，夏瑞祥

Treg和淋巴細胞亞群在急性髓系白血病中的意義

孔令君，葛 健，夏瑞祥

摘要目的 研究CD4＋CD25＋CD127low／－調節性T細胞（Treg）和淋巴細胞亞群在急性髓系白血病（AML）患者外周血中的變化、相互關系及臨床意義。方法 采用流式細胞儀對初治組和完全緩解（CR）組外周血Treg及淋巴細胞亞群水平進行檢測，并與正常對照組進行對比。結果 初治組和CR組AML患者外周血中Treg水平均高于正常對照組（P＜0.05），初治組高于CR組（P＜0.05）。初治組和CR組AML患者外周血的NK（CD3－CD16＋CD56＋）細胞占淋巴細胞的比例均低于正常對照組（P＜0.05），初治組低于CR組（P＜0.05）。初治組CD3＋T細胞、CD4＋T細胞含量和CD4＋／CD8＋比值均低于正常對照組（P＜0.05），但初治組CD8＋T細胞含量卻明顯高于正常對照組（P＜0.05）；CR組CD3＋T細胞、CD4＋T細胞、CD8＋T細胞含量及CD4＋／CD8＋比值接近正常對照組，與初治組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 AML患者外周血中Treg及CD8＋T細胞比例明顯升高，NK細胞、CD3＋T細胞、CD4＋T細胞含量和CD4＋／CD8＋比值降低，表明AML患者免疫功能處于抑制狀態。Treg控制CD8＋T細胞免疫應答，同時抑制NK細胞的天然免疫反應，在CD4＋T細胞與CD8＋T細胞平衡的失調中起主要作用，與AML疾病發生發展密切相關。通過下調Treg的數量或去除其抑制功能，優化AML患者的免疫治療。

關鍵詞急性髓系白血病；Treg；淋巴細胞亞群；NK細胞；腫瘤免疫

2014－12－30接收

作者單位：安徽醫科大學第一附屬醫院血液內科，合肥 230022

急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）是造血系統的惡性克隆性疾病，其發生、發展與機體免疫水平降低密切相關，尤其是細胞免疫異常。近年來，白血病的免疫治療逐漸成為白血病治療中的研究熱點。調節性T細胞（regulatory T cell， Treg）作為一群獨特的專職抑制細胞，主要分泌轉化生長因子-β和白細胞介素-10等細胞抑制因子，具有免疫抑制性和免疫無能性，在機體免疫穩態維持等方面起很重要作用。淋巴細胞亞群作為機體抗腫瘤免疫的重要活性細胞，執行細胞免疫功能，在抗腫瘤免疫效應中發揮了重要的作用。因此，檢測AML患者Treg、淋巴細胞亞群，對于探討AML免疫異常的實質及指導免疫相關的治療有著重要的意義。該研究采用流式細胞術檢測化療前后AML患者以及正常對照者外周血Treg及淋巴細胞亞群水平，探討其在AML患者化療前后外周血中的變化、相互關系以及在AML疾病發生發展中的作用，為臨床免疫治療AML提供依據。

1 材料與方法

1．1 病例資料 選取2013年4月～2014年9月在安徽醫科大學第一附屬醫院血液內科住院的AML患者30例作為實驗組，男14例，女16例；年齡20～74歲，中位年齡47.5歲；診斷符合《血液病診斷及療效標準》［1］。AML初治組與完全緩解（CR）組來源于同一患者不同標本，其中初治組未治療，CR組為已化療兩個療程，間隔1個月未接受化療。健康體檢者30例作為正常對照組，排除腫瘤與自身免疫性疾病史，男15例，女15例；年齡18～70歲，中位年齡46歲。組與組之間年齡、性別比較差異無統計學意義，具有可比性。

1．2 實驗器材和試劑 鼠抗人CD25-FITC、CD127-PE、CD4-PC5及同型對照抗體、CD3-FITC／CD（16＋56＋）-PE、CD4-FITC／CD8-PE／CD3-PC5、紅細胞裂解劑、磷酸鹽緩沖液（PBS）及NAVIOS流式細胞儀均購自美國COULTER公司。

1．3 方法

1．3．1 標本采集 分別采集白血病患者及健康體檢者的晨起空腹外周新鮮靜脈血3 ml，置于EDTA抗凝的真空采血管（去熱源與內毒素），輕輕混勻，于2 h內送至實驗室。

1．3．2 CD4＋CD25＋CD127low／－Treg檢測 取一支FACS專用試管，加入10 μl CD25-PC5、20 μl CD4-FI TC、20 μl CD127-PE；再加入EDTA-K2抗凝的全血

100 μl，渦旋混勻，避光15～20 min。加入1 ml溶血素，充分混勻，避光放置10 min；取出渦旋混勻，1 500 r／min離心5 min，棄上清液。加1 ml PBS混勻，4℃避光1 h內上機檢測。流式細胞儀檢測分析應用Navios tetra軟件，在FSC-SSC散點圖上選定淋巴細胞群，再以CD4和SSC設門選擇CD4陽性細胞分析CD4＋CD25high＋CD127low占CD4＋T細胞的百分率。收集細胞數30 000個／管。

1．3．3 淋巴細胞亞群檢測 采用直接免疫熒光法，取兩支FACS專用試管，各加入100 μl充分混勻的抗凝全血和10 μl CD45-PC5抗體，再分別加入5 μl CD4-FITC／CD8-PE／CD3-PC5抗體和10 μl CD3-FITC／CD（16＋56＋）-PE。渦旋混勻，室溫避光放置15～20 min。加入1 ml溶血素，充分混勻，避光放置10 min，觀察待測樣本裂解后呈均一透明紅色，管底無紅細胞沉淀。取出渦旋混勻，1 500 r／min，離心5 min，棄上清液。加1 ml PBS混勻，30 min內上機，用NAVIOS流式細胞儀分析系統軟件獲取30 000個細胞進行檢測。

1．4 統計學處理 應用SPSS 19．0軟件進行分析，數據均以±s表示。多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結果

2．1 CD4＋CD25＋CD127low／－Treg占CD4＋T細胞檢測率 初治組、CR組和正常對照組Treg檢測結果統計學分析顯示檢測率滿足方差齊性，3組均數差異有統計學意義（F＝43.67，P＜0.05）。3組間均數兩兩比較結果示：初治組（10.16±3.61）明顯高于CR組（8.53±2.97）和正常對照組（6.45± 1.84），差異均有統計學意義（P＜0.05）；CR組明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2．2 淋巴細胞亞群檢測率 初治組、CR組和正常對照組淋巴細胞亞群檢測結果統計學分析顯示：①NK細胞（CD16＋56＋）：檢測率滿足方差齊性，3組均數差異有統計學意義（F＝71.39，P＜0.05）。3組間均數兩兩比較結果示，初治組和CR組均低于正常對照組（P＜0.05），初治組低于CR組（P＜0.05）。②CD8＋T細胞：檢測率滿足方差齊性，3組均數差異有統計學意義（F＝13.69，P＜0.05）。3組間均數兩兩比較結果示，初治組均高于CR組和正常對照組（P＜0.05），CR組和正常對照組差異無統計學意義。③CD3＋T細胞、CD4＋T細胞、CD4＋／CD8＋：檢測率均滿足方差齊性，3組均數差異均有統計學意義（F＝22.57、19.26、33.86，P＜0.05）。3組間均數兩兩比較結果示，初治組均顯著低于CR組和正常對照組（P＜0.05），但CR組和正常對照組差異均無統計學意義。見表1。

表1　各組外周血淋巴細胞亞群檢測結果（±s）

表1　各組外周血淋巴細胞亞群檢測結果（±s）

與正常對照組比較：*P＜0.05；與初治組比較：＃P＜0.05

項目　　初治組　CR 組　　正常對照組CD3＋　66．06±8．47*　73．08±8．34＃72．91±7．88 CD4＋　32．08±8．80*　38．88±8．70＃　39．02±8．21 CD8＋　33．75±6．51*　30．76±5．74＃　30．66±6．12 CD4＋／CD8＋　0．95±0．19*　1．29±0．34＃　1．31±0．24 CD16＋56＋　4．77±1．95*　7．29±1．97*＃14．26±4．76

3 討論

Treg作為一類具有免疫負調控作用的T細胞，在腫瘤免疫和移植免疫中起重要作用。Treg在霍奇

金病患者腫瘤浸潤淋巴細胞中及胃癌、非小細胞肺癌等實體腫瘤患者的外周血中明顯增加［2－3］。該研究通過檢測30例初治AML患者及其化療達CR外周血Treg數量，并與正常對照者進行對比，表明初治組AML患者外周血Treg水平明顯高于CR組和正常對照組，且CR組高于正常對照組。這提示升高Treg能抑制細胞的正常免疫功能，導致腫瘤免疫逃逸，促進AML的疾病發生發展。研究［4］顯示，化療達CR的AML患者體內恢復的多數為Treg，這表明達CR的AML患者體內Treg含量仍維持著較高水平，與該研究結果一致。高水平的Treg的免疫抑制作用，使達CR的AML患者體內白血病細胞不能被完全清除，促使AML的復發。

Ustun et al［5］發現，AML患者體內表達吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）能使CD4＋CD25－T細胞轉化為CD4＋CD25＋T細胞，Treg含量明顯增多。在建立動物模型的體內實驗［6］中發現，這一過程可被IDO的特異性抑制劑1-甲基色氨酸所逆轉，1-甲基色氨酸還具有增強腫瘤化療藥物療效的作用。考慮可以通過IDO的特異性抑制劑靶向治療等方法降低體內的Treg含量，為臨床設計有效的抗腫瘤治療方案提供新的思路。

淋巴細胞亞群在腫瘤免疫中起中心調控作用，執行免疫調節功能和細胞免疫功能。本研究結果顯示初治AML患者外周血CD3＋T細胞、CD4＋T細胞及CD4＋／CD8＋比值較正常對照組均明顯降低，初治組CD8＋T細胞明顯高于正常對照組；初治組及CR組NK細胞水平均明顯低于正常對照組，而初治組低于CR組，差異有統計學意義。說明AML患者免疫調節功能紊亂，且Treg優勢狀態與NK細胞抑制狀態具有一致性。研究［7］顯示，Treg在機體免疫的初始階段促進CD8＋T細胞的免疫應答，之后限制CD8＋T細胞活性，而CD4＋／CD8＋只有在穩定比例的前提下才能維持細胞免疫反應的平衡。這說明Treg在CD4＋T細胞與CD8＋T細胞平衡的失調中起控制作用。吳澤霖等［8］發現在腫瘤患者體內Treg細胞膜表達的轉化生長因子-β直接抑制NK細胞的功能，并下調NK細胞表面受體NKG2D，從而抑制NK細胞的天然免疫反應。這說明Treg可能也對NK細胞起到同樣的調節作用，影響其對腫瘤細胞的廣譜殺傷作用，從而最終導致了白血病細胞的持續增長。

綜上所述，Treg和淋巴細胞亞群相互影響，促進機體細胞免疫功能的紊亂，最終導致AML的產生和發展。由于目前治療AML主要依靠化療和骨髓移植，治療過程中常出現嚴重的機體損傷，治療費用昂貴。考慮可以降低Treg的數量去除Treg的功能，為臨床治療AML設計有效的免疫治療方案。

參考文獻

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The significance of Treg and T lymphocyte subsets in acute myelocytic leukemia

Kong Lingjun，Ge Jian，Xia Ruixiang
（Dept of Hematology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

AbstractObjective To explore the alterations，relationship and clinical significance of CD4＋CD25＋CD127low／－

regulatory T cells（Treg）and lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with acute myelocytic leukemia （AML）．Methods The level of peripheral blood lymphocyte subsets and Treg of untreated AML patients and complete remission（CR）patients were tested by flow cytometry，and were compared with that of 30 normal controls．Results The proportions of Treg were much higher in untreated AML patients and CR patients than in normal controls，while the mean proportion of Treg in untreated AML patients was higher than that in CR patients（P＜0.05）．The proportions of NK（CD3－CD16＋CD56＋）cells in untreated AML patients and CR patients were both decreased compared with normal controls，and the mean proportion of NK cells in untreated AML patients was lower than that in CR patients（P＜0.05）．Compared with the normal controls，the proportions of CD3＋T cell，CD4＋T cell，and the ratio of CD4＋／CD8＋decreased in untreated AML patients（P＜0.05），but the proportions of CD8＋T cell was higher than in normal controls；the proportions of CD3＋T cell，CD4＋T cell，CD8＋T cell and the ratio of CD4＋／CD8＋in CR patients were close to the proportions in normal controls，but there was significant difference between CR patients and untreated AML patients（P＜0.05）．Conclusion The increase of Treg，CD8＋T cell and decrease of NK cells，CD3＋T cell，CD4＋T cell，and the ratio of CD4＋／CD8＋in peripheral blood of patients with AML indicate that the immune function of patients with AML is depressed．Treg control the immune response of CD8＋T cells，at the same time inhibit the natural immune response of NK cells，playing a major role in the disorders of CD4＋T cells and CD8＋T cell balance，and closely relate with the development of AML．The immune treatment of patients with AML will be optimised by reducing the amount of Treg or removing the suppression function．

Key wordsacute myelocytic leukemia；Treg；lymphocyte subsets；NK cells；tumor immunity

作者簡介：孔令君，女，碩士研究生；葛 健，男，副教授，副主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：gejian77＠medmail．com．cn；夏瑞祥，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：xrx2041＠163．com

基金項目：國家自然科學基金（編號：81200371）；高等學校博士學科點專項科研基金聯合資助課題（新教師類聯合資助課題）（編號：20123420120011）；安徽省自然科學基金（編號：1208085QH154）

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0512－04

中圖分類號R 733．71