狼瘡性腎炎患者HMGB1和RAGE的表達及意義

葉莉莉，徐星銘

狼瘡性腎炎患者HMGB1和RAGE的表達及意義

葉莉莉，徐星銘

摘要目的 探討高遷移率族蛋白B1（HMGB1）及晚期糖基化終產物受體（RAGE）在狼瘡性腎炎（LN）中的作用。方法 ELISA法檢測系統性紅斑狼瘡（SLE）患者及正常對照者血清、尿液中HMGB1的表達水平，免疫組化法檢測SLE患者及正常對照者腎組織中HMGB1及RAGE的表達水平。結果 SLE患者血清及尿液的HMGB1水平與正常對照者比較均升高（P＜0.01），活動期SLE患者較穩定期SLE患者明顯升高（P＜0.05）。狼瘡腎損害者血清HMGB1水平明顯高于狼瘡非腎損害者（P＜0.05）且與SLE疾病活動指數（SLEDAI）評分、24 h尿蛋白定量、白細胞計數呈正相關性（P＜0.05），尿液中HMGB1水平與SLEDAI評分呈正相關性（P ＜0.05）。正常對照者腎組織腎小管上皮細胞可中等強度表達HMGB1和RAGE，腎小球未見表達；而在SLE患者可見腎小管中表達有所增強，腎小球中也明顯表達，其腎內的HMGB1和RAGE的表達水平較正常對照者明顯增加（P＜0.05）；Ⅳ型、Ⅳ＋Ⅴ型SLE患者腎內HMGB1的表達量均明顯高于Ⅱ型（P＜0.05），Ⅳ型SLE患者腎內RAGE的表達量高于Ⅱ型（P＜0.05）。結論 HMGB1和RAGE可能參與了LN的發病過程，與疾病的病理變化有關。

關鍵詞系統性紅斑狼瘡；狼瘡性腎炎；高遷移率族蛋白B1；晚期糖基化終產物受體

2014－12－13接收

作者單位：安徽醫科大學第一附屬醫院腎臟內科，合肥 230022

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種自身免疫性疾病，其發病機制主要是致病性自身抗體的產生、免疫復合物的沉積、細胞因子的激活，腎臟是最常見的受累器官之一，是SLE患者的主要死因。高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein box 1，HMGB1）作為一種促炎細胞因子，在介導炎性細胞的活化、細胞因子的產生和分泌、免疫細胞的激活與遷移方面起著重要作用［1］。晚期糖基化終產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）是HMGB1的主要受體，兩者結合后通過核轉錄因子NF-κB的活化介導一系列炎癥反應［2］。關于HMGB1和RAGE在狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）患者腎內的表達罕見報道。該研究通過檢測HMGB1和RAGE在LN患者體內水平，探討兩者與LN的病理及臨床關系。

1 材料與方法

1．1 病例資料 收集2013年4月～2014年6月安徽醫科大學第一附屬醫院腎臟內科、風濕科、皮膚科共64例SLE住院患者血清（其中47例患者同時留取尿液），男6例，女58例，年齡17～51（34.19± 9.17）歲。患者均符合1997年美國風濕病協會修訂的SLE診斷標準。采用2000年SLE疾病活動指數（SLE disease activity index，SLEDAI-2000）進行評分。收集10例門診健康體檢者（各生化指標正常，自身抗體陰性，無糖尿病、高血壓、風濕免疫等疾病）的血清和尿液作為SLE患者血清和尿液的正常對照，其中男1例，女9例，年齡19～40（31.50± 5.80）歲。64例患者中有25例經腎活檢確診為LN（Ⅱ型6例、Ⅲ型4例、Ⅳ型10例、Ⅳ＋Ⅴ型5例）且每例腎組織切片中至少有8個腎小球。選取10例我院泌尿外科腎腫瘤切除患者遠離腫瘤部位至少2 cm的腎組織作為SLE患者腎組織的正常對照，經光鏡檢查腎組織無結構及病理改變。該實驗入選對象均知情并簽署同意書，同時符合院倫理委員會要求。

1．2 主要試劑 HMGB1的ELISA試劑盒購自蘇州卡爾文生物科技有限公司；兔抗人HMGB1多克隆抗體（bs-0664R）購自北京博奧森生物技術有限公司；兔抗人RAGE多克隆抗體（bs-4999R）購自北京博奧森生物技術有限公司；二抗試劑盒PV-9000購自北京中杉金橋生物技術有限公司；DAB顯色劑、PBS緩沖液、正常山羊血清封閉液、檸檬酸鹽緩沖液均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1．3 方法

1．3．1 血清和尿液標本采集及病理分型 SLE患者及正常對照者清晨空腹常規肘靜脈采血3 ml置于試管中。SLE患者尿液一般收集于首次入院后，正常對照者收集于門診的隨機尿，均以2 500 r／min離心10 min，分離血清置于－80℃冰箱保存待檢。腎活檢組織常規進行HE、PAS、Masson、PASM染色、免疫熒光，按2003年ISN及RPS標準行病理分型。

1．3．2 研究對象分組 SLE組：血標本（n＝64）、尿標本（n＝47）、腎組織標本（n＝25），正常對照組：血標本（n＝10）、尿標本（n＝10）、腎組織標本（n＝10）。SLE組患者采用SLEDAI-2000進行評分，≥10分為活動期，＜10分為穩定期，故SLE組按疾病活動性分為活動期SLE組［血標本（n＝47）、尿標本（n＝33）］和穩定期SLE組［血標本（n＝17）、尿標本（n＝14）］。SLE組以尿常規出現血尿（尿紅細胞數＞5個／HP）、管型尿或蛋白尿（24 h尿蛋白定量＞0.3 g或）為狼瘡腎損害，以無血尿、管型尿、蛋白尿（24 h尿蛋白定量＜0.3 g）為狼瘡無腎臟損害，故SLE組按尿常規結果分為狼瘡腎損害組［血標本（n＝37）、尿標本（n＝28）］和狼瘡非腎損害組［血標本（n＝27）、尿標本（n＝19）］。

1．3．3 臨床資料收集 收集患者的臨床指標，包括血常規、尿常規、肝功能、腎功能、24 h尿蛋白定量、免疫球蛋白補體、SLEDAI評分等，詢問患者激素及免疫抑制劑的使用情況。

1．3．4 ELISA法檢測血、尿HMGB1水平 按試劑盒說明書操作。

1．3．5 免疫組化法檢測腎組織中HMGB1和RAGE石蠟切片脫蠟、水化、微波熱抗原修復、山羊血清孵育、加入一抗（HMGB1 1∶200，RAGE 1∶75）4℃冰箱過夜，次日滴加二抗、DAB顯色、蘇木精復染、返藍、脫水、封片。圖片使用Image Pro-Plus 6．0圖像分析軟件處理，以高倍鏡下平均光密度值代表患者腎內HMGB1和RAGE表達水平。

1．4 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析，數據以±s表示。兩兩比較用t檢驗，多組間比較用方差分析，指標間相關性用Pearson相關分析。

2 結果

2．1 血清HMGB1水平及與臨床指標的相關分析SLE患者血清HMGB1的平均水平顯著高于正常對照者［（70.22±11.08）μg／L vs（44.84±8.31）μg／L］，差異有統計學意義（P＜0.01）。活動期SLE組顯著高于穩定期SLE組［（71.61±11.01）μg／L vs （65.32±9.40）μg／L］，差異有統計學意義（P＜0.05）。狼瘡腎損害組顯著高于狼瘡非腎損害者［（73.99±11.17）μg／L vs（65.04±8.75）μg／L］，差異有統計學意義（P＜0.05）。Pearson線性相關分析顯示HMGB1水平與SLEDAI評分、24 h尿蛋白定量、白細胞計數呈正相關性（r＝0.26、0.55、0.26，P ＜0.05），見圖1。與抗雙鏈DNA抗體滴度、抗核抗體濃度、免疫球蛋白補體、C反應蛋白、血小板無明顯相關性。

2．2 尿液HMGB1水平及與臨床指標的相關性分析 SLE患者尿液HMGB1的平均水平顯著高于正常對照者［（60.53±5.80）μg／L vs（24.25±6.17）μg／L］，差異有統計學意義（P＜0.01）。活動期SLE組顯著高于穩定期組［（61.65±5.47）μg／L vs （57.89±5.90）μg／L］，差異有統計學意義（P＜0.05）。狼瘡腎損害組較狼瘡非腎損害組差異無統計學意義［（61.17±5.56）μg／L vs（59.59±6.18）

μg／L］。Pearson相關分析提示尿液HMGB1水平與SLEDAI評分呈正相關性（r＝0.35，P＜0.05），與24 h尿蛋白定量、白細胞計數、血小板計數、抗雙鏈DNA抗體滴度、抗核抗體濃度、免疫球蛋白補體、C反應蛋白無明顯相關性。見圖2。

2．3 HMGB1在腎組織中的表達 HMGB1在正常對照者腎組織的腎小管上皮細胞可見中等程度表達，胞核表達為多，腎小球未見表達；而在SLE患者腎組織中，腎小管上皮細胞HMGB1的表達明顯增強，腎小球也出現中等強度表達，主要表達于細胞質及細胞外，與正常對照者腎組織比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3、表1。SLE組腎組織中HMGB1的平均光密度值比較，其中以Ⅱ型表達最弱，Ⅱ型較Ⅳ型和Ⅳ＋Ⅴ型相比差異有統計學意義（P＜0.05）；而Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅳ＋Ⅴ型之間差異無統計學意義。

表1　SLE患者與正常對照者腎組織內HMGB1、RAGE表達水平（n，±s）

表1　SLE患者與正常對照者腎組織內HMGB1、RAGE表達水平（n，±s）

與正常對照者比較：*P＜0.05；與Ⅱ型比較：＃P＜0.05

組別　n　HMGB1平均光密度值RAGE平均光密度值正常對照10　0．249 6±0．040 7　0．280 1±0．041 6 SLE　25　0．338 1±0．037 7*　0．351 1±0．033 2*Ⅱ型　6　0．301 2±0．036 7*　0．325 4±0．024 7*Ⅲ型　4　0．332 5±0．021 1*　0．360 2±0．038 7*Ⅳ型　10　0．354 6±0．027 4*＃　0．368 8±0．033 1*＃Ⅳ＋Ⅴ型　5　0．353 9±0．041 9*＃　0．339 4±0．015 2*

2．4 RAGE在腎組織中的表達 RAGE在正常對照者腎小管上皮細胞中等強度表達，腎小球未見表達；在SLE患者腎小管上皮細胞表達增強，腎小球也較強表達，主要表達于細胞膜、細胞質及細胞外，炎性浸潤區也可見明顯表達。見圖4。與正常腎組織比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。SLE組腎組織中RAGE的平均光密度值比較：Ⅱ型表達最輕，Ⅱ型較Ⅳ型相比差異有統計學意義（P＜0.05），而Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅳ＋Ⅴ型之間差異無統計學意義。

3 討論

HMGB1是一種高度保守的染色質蛋白，主要存

在于真核細胞內，參與維持染色體結構的穩定，調節基因的轉錄、修復等［3］。當單核巨噬細胞、樹突狀細胞等受到刺激后可主動分泌HMGB1，組織細胞受損、凋亡、壞死后也可被動釋放HMGB1［4］。細胞外的HMGB1與細胞膜上特異性受體（如RAGE）結合，刺激炎性細胞的活化聚集，促進細胞因子（如IL-1、TNF-α等）的大量釋放，同時HMGB1做為一個內源性免疫佐劑，對樹突狀細胞的成熟遷移、輔助性T細胞的極化起重要作用［5－6］。

本研究顯示SLE患者血清HMGB1水平顯著高于正常對照者，與研究［7］結果一致。穩定期SLE組單核細胞等相對處于靜止狀態，而活動期SLE組外周血中存在較多的促炎細胞因子，免疫細胞相對活化，更多的HMGB1由細胞核分泌至細胞外。SLE患者SLEDAI評分越高，其狼瘡活動度就越高，免疫細胞的活化及細胞因子的產生隨之升高；活動期SLE組血清HMGB1水平明顯高于穩定期SLE組，與SLEDAI評分呈正相關性。這與研究［8］結果一致，提示HMGB1參與了SLE的發病，與疾病的活動有關。

研究［9］顯示致病性抗雙鏈DNA抗體1A3F上調腎小球系膜細胞促炎癥反應基因誘導狼瘡腎損害的主要作用機制與內源性損傷分子HMGB1相結合有關，在抗雙鏈DNA抗體誘導的腎臟損害中，HMGB1作為一種促炎癥反應的調停者，在LN的發病機制中至關重要。本實驗顯示狼瘡腎損害組血清HMGB1水平明顯高于狼瘡非腎損害組，且與24 h尿蛋白定量呈正相關性。同時本實驗還檢測了患者尿液中HMGB1的水平，顯示SLE患者尿液HMGB1水平顯著高于健康對照者，與研究［10］結果一致，尤以活動期SLE患者為甚，與SLEDAI評分呈正相關性，但并未表明其在狼瘡腎損害者與狼瘡非腎損害者之間的差異，有待進一步探究。研究［11］顯示HMGB1不僅在LN大鼠的血清中升高，在腎組織中可見顯著表達，本研究對不同病理類型SLE患者腎組織中的HMGB1表達進行免疫組化檢測顯示在正常對照者腎小管上皮細胞可見中等強度表達，而在SLE患者腎小管上皮細胞的表達增強，腎小球也出現較強表達，其中Ⅱ型的表達量較輕，Ⅳ型、Ⅳ＋Ⅴ型的表達量較為嚴重，提示HMGB1可能參與了LN的病理發展過程。

研究［2］顯示HMGB1與其主要受體RAGE相結合激活NF-κB途徑，引發一系列炎癥反應；在RAGE基因敲除鼠中其炎癥因子的分泌下降70%［12］，這說明HMGB1的促炎作用在很大程度上依賴RAGE。本研究顯示正常對照者的腎組織中腎小球未見RAGE的表達，腎小管中度表達；而在SLE患者中腎小球、腎小管均強表達，且Ⅱ型表達較輕，Ⅳ型最強，在LN病變中以Ⅰ型、Ⅱ型為輕，Ⅳ型最重，RAGE在不同病理類型LN腎組織的表達程度與LN的病理嚴重度相當，提示RAGE可以作為預測LN病變嚴重程度的指標之一。

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Expression and significance of HMGB1and RAGE in patients with lupus nephritis

Ye Lili，Xu Xingming
（Dept of Nephrology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

AbstractObjective To explore the role of high mobility group box protein 1（HMGB1）and receptor for advanced glycation endproducts（RAGE）in lupus nephritis（LN）．Methods The serum and urine levels of HMGB1 were detected by ELISA in SLE patients and normal controls，and intrarenal expressions of HMGB1 and RAGE were detected by immunohistochemistry in renal tissues of SLE patients and normal-appearing renal tissues．Results The serum and urine levels of HMGB1 were significantly higher in SLE patients compared to healthy controls（P ＜0.01），in patients with active disease compared to those with inactive disease（P＜0.05），serum levels of HMGB1 were found to be significantly higher in patients with renal involvement compared to those without renal involvement（P＜0.05）．In addition，the levels of serum HMGB1 showed positive correlation with SLEDAI，urine protein（24 h）and lencocyte count（P＜0.05）．The expression of urine HMGB1 showed positive correlation with SLEDAI（P＜0.05）．Intermediate-intensity staining of HMGB1 and RAGE was detected in renal tubules in normalappearing renal tissues，however，both renal tubules and glomerular cells had the strong expression of HMGB1 and RAGE in SLE patients．The intrarenal production of HMGB1 and RAGE in SLE patients was obviously higher than that in normal-appearing renal tissues（P＜0.05），and the expression levels of HMGB1 in SLE IV and IV＋V were higher than those in SLE II（P＜0.05）．The expression levels of RAGE in SLE IV were higher than those in SLE II（P＜0.05）．Conclusion HMGB1 and RAGE may play key roles in the pathogenesis of LN and may associate with the pathology category of LN．

Key wordssystemic lupus erythematosus；lupus nephritis；high mobility group box protein 1；advanced glycation endproducts

作者簡介：葉莉莉，女，碩士研究生；徐星銘，女，副教授，副主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：xxm2425＠163．com

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0533－05

中圖分類號R 593．242