蝸牛酶促毛蕊異黃酮苷轉化成毛蕊異黃酮的條件研究*

張亞洲，王 濤，宋 強，鄒樹良，朱金秋，劉海林

（1.貴州理工學院，貴州 貴陽 550003；2.廣西壯族自治區藥用植物園，廣西南寧 530000；3.西藏格創制藥有限公司，西藏拉薩 850000）

蝸牛酶促毛蕊異黃酮苷轉化成毛蕊異黃酮的條件研究*

張亞洲1，2，王 濤1，宋 強3，鄒樹良1，朱金秋1，劉海林1

（1.貴州理工學院，貴州 貴陽 550003；2.廣西壯族自治區藥用植物園，廣西南寧 530000；3.西藏格創制藥有限公司，西藏拉薩 850000）

目的探討蝸牛酶酶解毛蕊異黃酮苷轉化生成毛蕊異黃酮的最佳轉化條件和方法。方法采用恒溫搖床，將蝸牛酶溶于合適溫度的水中，加入用DMSO溶解的苷，邊加邊攪拌，加完后反應30 min，最后用乙腈終止反應。通過反復重結晶得到所需要的苷元。結果最佳轉化條件為，當蝸牛酶與毛蕊異黃酮苷的比例為1∶2時，加入200 mL的保溫35～37℃水中，待蝸牛酶溶解均勻后，再加入毛蕊異黃酮苷（溶于1 mL的DMSO中），pH維持5～8，孵化0.5 h后，用乙腈等量終止反應。結論該法能有效使毛蕊異黃酮苷轉化為純度大于98%的毛蕊異黃酮，方法簡單，易于操作。

蝸牛酶；毛蕊異黃酮苷；毛蕊異黃酮；轉化

毛蕊異黃酮是來源于蒙古黃芪 Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao中有雌激素樣作用的異黃酮類活性化合物，在其中含量最高，也一直是藥學研究的熱點[1]。蝸牛酶是從蝸牛的嗦囊和消化道中提取物制備的混合酶[2-4]，含有纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20多種，是一種 β-D-葡萄糖水解酶，能有效水解 β-D-葡萄糖結合的糖苷，從而制備糖上連接的相應苷元[5-6]。筆者對蝸牛酶水解毛蕊異黃酮苷去掉7位葡萄糖后制備毛蕊異黃酮的方法進行了研究，現報道如下。

1 儀器與試藥

DIONEX ultimate 3000型高效液相色譜儀；恒溫水浴鍋（江蘇常州順華儀器設備有限公司）。水為純水；乙腈（天津市西華特種試劑廠，批號為20120911）均為分析純，甲醇（天津市西華特種試劑廠，批號為20120911），蝸牛酶（上海源葉生物技術有限公司）。毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮(四川維克奇試劑有限公司，批號分別為20100327，20100523)含量均大于99.5%。

2 方法與結果

2.1 含量測定條件

色譜柱：菲羅門C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL/min；流動相[7-8]：乙腈-水(25∶75)。2.2 轉化條件優選

孵化溶液與用量：稱取200 mg的蝸牛酶，分別加入100，200， 300 mL的保溫（37±0.2）℃水中，溶解均勻后，再加入毛蕊異黃酮苷200 mg（溶于1 mL的DMSO中），孵化1 h后，用乙腈等量終止反應。超聲后搖勻后取樣，微孔濾膜過濾，20 μL進樣，記錄色譜圖，見圖1，結果見表1。結果加入的水量沒有較明顯的影響。

圖1 高效液相色譜圖

孵化中蝸牛酶與毛蕊異黃酮的用量比例：稱取200 mg的蝸牛酶，分別加入200 mL的保溫（37±0.2）℃水中，溶解均勻后，再分別加入毛蕊異黃酮苷 200，300，400，500 mg（溶于 1 mL的DMSO中），孵化1 h后，用乙腈等量終止反應。超聲后搖勻后取樣，微孔濾膜過濾，20 μL進樣，記錄色譜圖，結果見表2。當酶與毛蕊異黃酮苷比例(酶∶藥)小于2時，轉化率（A/mg）相差不大(RSD=0.25%)。

表1 蝸牛酶在不同體積的水中轉化情況

表2 不同比例的毛蕊異黃酮苷和蝸牛酶的轉化情況

孵化時間：稱取200 mg的蝸牛酶，分別加入200 mL的保溫（37±0.2）℃水中，溶解均勻后，再分別加入毛蕊異黃酮苷200 mg（溶于1 mL的DMSO中），孵化0.5，1，1.5 h后，用乙腈等量終止反應。超聲后搖勻后取樣，微孔濾膜過濾，20 μL進樣，記錄色譜圖，結果見表3。孵化時間在30 min后2 h內轉化率沒有差異。

表3 不同孵化時間毛蕊異黃酮苷的轉化情況

孵化時溫度：稱取200 mg的蝸牛酶，分別加入200 mL的保溫(35±0.2)℃、(37±0.2)℃、(39±0.2)℃水中，溶解均勻后，再分別加入毛蕊異黃酮苷200 mg（溶于1 mL的DMSO中），孵化0.5 h后，用乙腈等量終止反應。超聲后搖勻后取樣，微孔濾膜過濾，20 μL進樣，記錄色譜圖，結果見表4。孵化時溫度35～37℃時的轉化效果較好。

表4 不同孵化溫度對毛蕊異黃酮苷的轉化情況

孵化時pH：稱取200 mg的蝸牛酶，分別加入200 mL的保溫(37±0.2)℃水中，溶解均勻后，再分別加入毛蕊異黃酮苷200 mg（溶于1 mL的DMSO中），設立孵化時 pH為5.0，6.0，7.0，8.0，孵化0.5 h后，用乙腈等量終止反應。超聲后搖勻后取樣，微孔濾膜過濾，20 μL進樣，記錄色譜圖，結果見表5。孵化時pH在5～8時的轉化效果較好。

表5 不同孵化時pH對毛蕊異黃酮苷的轉化情況

酶解終止溶劑：稱取200 mg的蝸牛酶，分別加入200 mL的保溫(37±0.2)℃水中，溶解均勻后，再分別加入毛蕊異黃酮苷200 mg（溶于1 mL的DMSO中），孵化0.5 h后，分別用乙腈、甲醇、乙酸乙酯等量終止反應。超聲后搖勻后取樣，微孔濾膜過濾，20 μL進樣，結果見表6。不同孵化的終止溶劑甲醇與乙腈對毛蕊異黃酮苷轉化情況的影響較小。

表6 不同孵化的終止劑對毛蕊異黃酮苷的轉化情況

2.3 酶解反應條件確定

綜合以上試驗結果，用蝸牛酶水解毛蕊異黃酮苷得到毛蕊異黃酮時，稱取 1份蝸牛酶，分別加入 100倍的保溫35～37℃水中，待蝸牛酶溶解均勻后，再分別加入的毛蕊異黃酮苷（2倍量蝸牛酶以下，溶于1 mL的 DMSO中），pH維持在5～8，孵化0.5 h后，用乙腈等量終止反應，結果見表7。3次試驗中轉化率均大于98%，結果較穩定（RSD=0.14%），均達到了要求，可以用來制備高純度的毛蕊異黃酮（含量＞98%）。

表7 3次不同試驗中毛蕊異黃酮苷的轉化情況

3 討論

自然界植物中所含苷以β-D-葡萄糖苷形成的苷元為主，β-D-葡萄糖苷占植物中分離所得苷的90%以上，新鮮植物中苷的含量一般大于對應的苷元[9]。由于苷在口服后均經腸道細菌轉化為苷元而吸收，故在進行研究時一般多采用苷元[10]。

蝸牛酶是一種具有專屬性的β-D-葡萄糖苷轉化酶。蝸牛酶酶解反應系統簡單，對環境不產生污染，轉化體系中的水用純凈水或自來水的影響較小；再者，酶解反應具有專屬性強、反應迅速、要求簡單、經濟、實惠等優點，可成為工業中應用的一個理想選擇[2，4]。本試驗結果顯示，轉化時 pH在5～7時轉化效果較好；溫度控制在35～37℃時孵化，轉化效果較好；轉化速度較快，均可在30 min后既可達到平衡。本研究為水解β-D-葡萄糖苷提供了方法和借鑒，方法與設備簡單，且易操作，是一種進行相關轉化的實用、可行的優良方法。

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Calycosin-7-O-β-D-Glucoside Transformation into Calycosin by Incubation with the Snailase

Zhang Yazhou1,2，Wang Tao1，Song Qiang3,Zou Shuliang1，Zhu Jinqiu1,Liu Hailin1
(1 Guizhou Institute of Technology,Guiyang,Guizhou,China 550003; 2 Guangxi Medicinal Botanical Garden,Nanning,Guangxi,China 530000; 3.Xizang Gechuang Pharmaceutical Co.,Ltd.,Lasa,Xizang,China 850000)

Objective To study the best best conditions and methods to conduct the transformation of calycosin-7-O-β-D-glucoside into calycosin using the enzymatic hydrolysis with snailase.M ethods The snailase was dissolved in a suitable water in constant temperature shaking table and then added dimethyl sulfoxide(DMSO)which calycosin-7-O-β-D-glucoside was dissolved in,kept the reaction for 30 min,and finally terminated the reaction with acetonitrile.Results When the snailase and calycosin-7-O-β-D-glucoside were in the ratio of 1∶2,added with 200 mL water(keeping in 35-37℃),added calycosin-7-O-β-D-glucoside that was dissolved in 1 mL of DMSO,and the pH was maintained at between 5-8,then quenched with an equal amount of acetonitrile after incubating 0.5 h.Conclusion This method can easily transform the calycosin-7-O-β-D-glucose into calycosin(＞98%),and the operating process is simple and effective.

snailase;calycosin-7-O-β-D-glucoside;calycosin

R284；R282.71

A

1006-4931(2015)19-0021-03

張亞洲（1980-），男，博士研究生，副教授，研究方向為天然藥物的活性成分發現和代謝研究，(電話)0851-88210721（電子信箱）zhangyazhou＠git.edu.cn。

2015-04-09)

*廣西自然科學基金（黃芪皂苷Ⅳ，Ⅱ及其苷元環黃芪醇的代謝研究），項目編號：2013GXNSFBAO19187；貴州理工學院項目（山豆根中的主要有效物質基礎的體內有效物質形式研究)，項目編號：XJGC20141106。