石榴種皮木質(zhì)素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因PgMYB的克隆與表達(dá)

曹丹琴,楊　健,關(guān)曉彎,張永娟,龔凌燕,張水明

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,合肥 230036)

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石榴種皮木質(zhì)素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因PgMYB的克隆與表達(dá)

曹丹琴,楊健,關(guān)曉彎,張永娟,龔凌燕,張水明*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,合肥 230036)

摘要:為初步探討石榴(PunicagranatumL.)籽粒硬度產(chǎn)生機(jī)理及轉(zhuǎn)錄因子基因PgMYB在石榴種皮木質(zhì)素生物合成途徑中的作用,測(cè)定了不同石榴品種籽粒硬度及種皮總木質(zhì)素含量并分析兩者關(guān)系,利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù),克隆了‘紅玉石籽’石榴的1個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因(PgMYB),通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了PgMYB的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明:(1)石榴籽粒硬度與種皮總木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.906。(2)PgMYB基因cDNA全長(zhǎng)1 088 bp,開(kāi)放閱讀框921 bp,編碼蛋白由306個(gè)氨基酸組成,N端具有2個(gè)MYB DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,是植物中一個(gè)典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子;同源分析顯示,該基因編碼的氨基酸序列與銀合歡的MYB1和擬南芥的MYB4一致性分別高達(dá)89%和84%。(3)在不同籽粒硬度石榴品種中PgMYB的表達(dá)與籽粒硬度和種皮總木質(zhì)素含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。(4)在石榴各個(gè)發(fā)育時(shí)期中,PgMYB表達(dá)與種皮總木質(zhì)素含量同樣呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。推測(cè)該基因可能抑制石榴種皮總木質(zhì)素的生物合成。

關(guān)鍵詞:石榴;籽粒硬度;種皮;總木質(zhì)素;PgMYB基因;表達(dá)分析

石榴(PunicagranatumL.)為石榴科石榴屬多年生落葉果樹(shù),主要分布在陜西、安徽、山東、四川、新疆、云南等地[1]。石榴果實(shí)中含有豐富的天然活性物質(zhì),具有較高的保健價(jià)值[2]。石榴中的軟籽品種核軟可食,無(wú)需吐籽,因而更受消費(fèi)者喜愛(ài),但有關(guān)軟籽性狀形成機(jī)理的研究甚少。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)在棗莊的調(diào)查發(fā)現(xiàn)石榴樹(shù)隨著更新次數(shù)的增加,果實(shí)種子有退化變軟現(xiàn)象[3]。陸麗娟等[4]研究中國(guó)代表性石榴品種硬度時(shí)指出石榴種子硬度性狀可能受多基因控制,且可能存在主效基因,同時(shí)發(fā)現(xiàn)光照、樹(shù)體營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境因素對(duì)種子硬度也具有一定影響。

石榴籽粒包含假種皮、種皮和種仁等3個(gè)部分,通常可食用部分為假種皮,種仁中富含多種脂肪酸和蛋白質(zhì),具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5],而種皮中木質(zhì)素含量較高[6]。木質(zhì)素是植物體內(nèi)的一種芳香性高聚物,主要沉積在維管植物次生增厚的細(xì)胞壁中[7]。木質(zhì)素的生物合成主要受兩類基因控制,一類是結(jié)構(gòu)基因,另一類是調(diào)節(jié)基因。研究發(fā)現(xiàn),MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物苯丙烷類次生代謝途徑的調(diào)節(jié),該過(guò)程與木質(zhì)素的合成調(diào)控密切相關(guān)[8-9]。根據(jù)高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域R的數(shù)目,可以把MYB轉(zhuǎn)錄因子分為單一MYB結(jié)構(gòu)域蛋白(R3-MYB)、2個(gè)重復(fù)MYB結(jié)構(gòu)域蛋白(R2R3-MYB)和3個(gè)重復(fù)MYB結(jié)構(gòu)域蛋白(R1R2R3-MYB)[10]。其中R2R3-MYB可能是最直接調(diào)控木質(zhì)素生物合成與沉積的轉(zhuǎn)錄因子,它們能調(diào)控參與苯丙烷類物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá),從而影響木質(zhì)素的含量[11]。如火炬松(Pinustaeda)的PtMYB1、PtMYB4和PtMYB8[12-13],擬南芥的AtMYB58、AtMYB63[14]促進(jìn)木質(zhì)素的生物合成。玉米(Zeamays)的ZmMYB31和ZmMYB42[15],擬南芥的AtMYB4[16],雜交楊(PopulustremulaL.×tremuloidesMichx.)的PttMYB21a[17],銀合歡(Leucaenaleucocephala)的LlMYB1[18],金魚(yú)草(AntirrhinummajusL.)的AmMYB308和AmMYB330[19]則抑制木質(zhì)素的生物合成。在石榴中尚未見(jiàn)到關(guān)于木質(zhì)素生物合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究報(bào)道。

本研究通過(guò)測(cè)定不同石榴品種的籽粒硬度與種皮總木質(zhì)素含量,分析兩者相關(guān)性,同時(shí)從參與木質(zhì)素合成代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控手段入手,應(yīng)用RACE技術(shù)克隆PgMYB基因cDNA全長(zhǎng),Real time-PCR技術(shù)分析PgMYB在石榴不同品種和不同發(fā)育時(shí)期種皮中的表達(dá)特性,為深入研究石榴軟籽性狀形成機(jī)理打下了基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

材料采自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)園石榴資源圃,土肥水管理水平一致。于2013年9月15日分別采集5年樹(shù)齡的‘突尼斯軟籽’、‘會(huì)理軟籽’和‘紅玉石籽’3個(gè)不同硬度品種成熟度一致的果實(shí)若干,剝?nèi)∈褡蚜?部分4 ℃保存,用于籽粒硬度和總木質(zhì)素含量測(cè)定;部分-80 ℃保存,用于基因克隆與表達(dá)。

2013年5月20日始,在花后20、40、60、80、100和120 d,分別從‘紅玉石籽’樹(shù)冠外圍東、西、南、北面及內(nèi)膛枝條上摘取同期坐果、大小一致果實(shí)各2個(gè),剝?nèi)∈褡蚜?部分4 ℃保存,用于總木質(zhì)素含量測(cè)定;部分-80 ℃保存,用于基因表達(dá)分析。

1.2不同品種石榴籽粒硬度測(cè)定

隨機(jī)選取‘突尼斯軟籽’、‘會(huì)理軟籽’和‘紅玉石籽’3個(gè)品種的石榴籽粒各20個(gè),去除外層假種皮,擦凈待用。選用Texture Analyser質(zhì)構(gòu)儀P/36R圓柱型平底探頭,在質(zhì)構(gòu)剖面分析(Texture Profile Analysis,TPA)測(cè)試模式下,設(shè)定0.5 mm的目標(biāo)壓縮形變量(進(jìn)入樣品的運(yùn)行距離),探頭對(duì)樣品進(jìn)行兩次壓縮循環(huán),測(cè)得所需的硬度質(zhì)構(gòu)指標(biāo),單位為g·cm-2。

1.3總木質(zhì)素含量測(cè)定

采用巰基乙酸法[20]分別對(duì)‘突尼斯軟籽’、‘會(huì)理軟籽’、‘紅玉石籽’3個(gè)石榴品種和花后20、40、60、80、100和120 d的‘紅玉石籽’石榴種皮的總木質(zhì)素含量進(jìn)行測(cè)定,各樣品測(cè)定均3次重復(fù)取平均值。

1.4PgMYB基因cDNA全長(zhǎng)克隆及生物信息學(xué)分析

1.4.1石榴MYB基因中間片段的獲得根據(jù)GenBank上已經(jīng)登錄的幾種植物MYB基因的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域保守區(qū)設(shè)計(jì)目的片段擴(kuò)增引物MYB-F和MYB-R(表1),參照改良的CTAB法[21]提純‘紅玉石籽’石榴種皮的總RNA,以其為模板進(jìn)行RT-PCR,PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 延伸10 min,PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收并連接至pGEM-Teasy載體(Promega公司)上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(上海康潤(rùn)生物公司)進(jìn)行克隆,挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR檢測(cè),將陽(yáng)性菌落送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4.2cDNA末端擴(kuò)增根據(jù)獲得的MYB中間片段核苷酸序列,設(shè)計(jì)用于3′端和5′端克隆的基因特異引物(表1)。以3′-CDS為接頭(表1),反轉(zhuǎn)錄得到3′-RACE cDNA,分別用3′GSP1、3′GSP2和3′通用引物UPM-Long和NUP進(jìn)行3′端擴(kuò)增,具體操作流程參照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit User Manual試劑盒(Clontech公司)說(shuō)明書進(jìn)行。用5′MYB-F1和5′MYB-R1進(jìn)行5′端序列克隆,回收擴(kuò)增產(chǎn)物并連接至pGEM-Teasy載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序鑒定。

1.4.3PgMYB全長(zhǎng)cDNA拼接及生物信息學(xué)分析將獲得的MYB中間片段和cDNA末端序列進(jìn)行拼接,獲得PgMYB基因的cDNA全長(zhǎng)序列。將PgMYB序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST工具進(jìn)行同源分析;利用ORF(Open Reading Frame,ORF)finder軟件尋找開(kāi)放閱讀框;Protparam軟件(http://web.expasy.org/protparam/)分析編碼蛋白的氨基酸序列組成、分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì);Psort(http://psort.hgc.jp/form.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析;BioXM 2.6軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)一致性和相似性分析;用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5PgMYB表達(dá)分析

1.5.1PgMYB在不同品種石榴種皮的表達(dá)分析運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)PgMYB基因在‘突尼斯軟籽’、‘會(huì)理軟籽’和‘紅玉石籽’3個(gè)品種石榴種皮中的表達(dá)情況,以石榴Actin為內(nèi)參,設(shè)計(jì)特異引物PgActin-F/PgActin-R及PgMYB-F/PgMYB-R(表1),在Step One PlusTM熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。采用20 μL反應(yīng)體系:SYBRTMPremixExTaq10 μL,10 μmol·L-1的上下游引物各0.8 μL,ROX Reference Dye 50X 0.4 μL,cDNA模板2.0 μL,ddH2O 6.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸 1 min,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品4次重復(fù)。反應(yīng)完成后,用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

1.5.2PgMYB在不同發(fā)育時(shí)期石榴種皮的表達(dá)分析以花后20、40、60、80、100和120 d的‘紅玉石籽’種皮cDNA為模板,以石榴Actin為內(nèi)參,對(duì)PgMYB基因表達(dá)量進(jìn)行熒光定量檢測(cè),具體方法同1.5.1。

2結(jié)果與分析

2.1石榴不同品種籽粒硬度和種皮總木質(zhì)素含量

3個(gè)石榴品種中,‘突尼斯軟籽’籽粒硬度最小,種皮總木質(zhì)素含量最低,分別為1 997 g·cm-2和6.36%;其次是‘會(huì)理軟籽’,籽粒硬度為3 811 g·cm-2,種皮總木質(zhì)素含量為7.57%;籽粒硬度和種皮總木質(zhì)素含量均最大的為‘紅玉石籽’,分別為4 235 g·cm-2和9.25%(圖1)。SPSS分析發(fā)現(xiàn),石榴籽粒硬度與種皮總木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.906。

表1　PCR擴(kuò)增所用引物及其序列

2.2石榴PgMYB基因的克隆

RT-PCR擴(kuò)增MYB基因cDNA同源片段,挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序得到一個(gè)長(zhǎng)291 bp的核酸片段(圖2,A),序列比對(duì)結(jié)果顯示,該片段序列與水稻(Oryzasativa)的OsMYB2和玉米的ZmMYB31序列一致性分別高達(dá)87%和86%,初步判斷該片段為石榴MYB基因序列片段。

3′端擴(kuò)增得到一個(gè)819 bp的帶有多聚A尾巴的片段(圖2,B),登陸NCBI進(jìn)行核酸序列比對(duì),表明該片段序列與玉米的ZmMYB31和柳枝稷(Panicumvirgatum)的PvMYB4a序列一致性高達(dá)85%,且3′端序列與原同源片段部分重疊,確認(rèn)其為石榴MYB基因的3′端序列。5′端擴(kuò)增得到一個(gè)長(zhǎng)436 bp的片段(圖2,C),序列比對(duì)分析確定為石榴MYB基因的5′端序列。

2.3PgMYB全長(zhǎng)cDNA拼接及生物信息學(xué)分析

將獲得的兩端序列與同源片段序列進(jìn)行拼接得到一個(gè)長(zhǎng)1 088 bp的cDNA序列。序列分析表明,PgMYB基因編碼區(qū)由921個(gè)核苷酸組成,編碼一個(gè)含有306個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),起始密碼子為ATG,終止密碼子為TGA(圖3)。NCBI在線比對(duì)發(fā)現(xiàn),該基因編碼的氨基酸序列與銀合歡、楊樹(shù)(Populus)、擬南芥等植物中MYB轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的氨基酸序列一致性都達(dá)到84%以上。Protparam分析其理化性質(zhì),推測(cè)該蛋白的分子式C1468H2332N454O461S17,相對(duì)分子量為34 262.4,等電點(diǎn)(pI)為8.85。InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定結(jié)果顯示,Pg-MYB具有兩個(gè)典型的MYB-DNA-binding結(jié)構(gòu)域(圖4),為典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因。亞細(xì)胞定位研究表明,PgMYB蛋白定位于細(xì)胞核(可能性91.3%),符合轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位特征。將PgMYB推導(dǎo)的氨基酸序列與其他植物中調(diào)控木質(zhì)素合成代謝的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5),發(fā)現(xiàn)PgMYB與桉樹(shù)(Eucalyptusgunnii)的EgMYB1(GenBank登錄號(hào):AJ576024.1)和擬南芥AtMYB32(GenBank登錄號(hào):NM_119665.2)進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較近。GenBank中做同源性分析表明PgMYB基因氨基酸序列與其他MYB轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的同源區(qū)域主要集中在N端R2R3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,在C端同源性極低。

2.4不同品種石榴種皮PgMYB的表達(dá)和總木質(zhì)素含量分析

在籽粒硬度最小的‘突尼斯軟籽’中PgMYB相對(duì)表達(dá)量最大,以‘突尼斯軟籽’為1,‘會(huì)理軟籽’中PgMYB表達(dá)量為‘突尼斯軟籽’的0.38,籽粒硬度最大的‘紅玉石籽’中PgMYB表達(dá)量最低,僅為‘突尼斯軟籽’的0.23。籽粒硬度越小的品種,Pg-MYB表達(dá)量越高,同時(shí)種皮總木質(zhì)素含量就越低,相關(guān)分析結(jié)果顯示,PgMYB的表達(dá)與籽粒硬度和種皮總木質(zhì)素含量呈負(fù)相關(guān)(圖6)。

圖1　石榴不同品種籽粒硬度和種皮總木質(zhì)素含量

圖3　PgMYB基因的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列

圖2　PgMYB基因同源片段(A)、3′-RACE(B)和5′-RACE(C)擴(kuò)增結(jié)果

圖4　不同植物MYB氨基酸序列比對(duì)

圖5　木質(zhì)素合成相關(guān)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化樹(shù)

2.5不同發(fā)育時(shí)期石榴種皮PgMYB的表達(dá)和總木質(zhì)素含量分析

RT-PCR分析PgMYB在‘紅玉石籽’不同發(fā)育時(shí)期種皮中的表達(dá)特性(圖7)發(fā)現(xiàn):在花后20 d,PgMYB表達(dá)量最高,且隨著果實(shí)發(fā)育,PgMYB的表達(dá)量逐漸下降。巰基乙酸法測(cè)定‘紅玉石籽’不同發(fā)育時(shí)期種皮的總木質(zhì)素含量(圖7),結(jié)果顯示:盛花后20、40、60、80、100和120 d,木質(zhì)素含量持續(xù)上升,在果實(shí)發(fā)育前期,木質(zhì)素含量積累較快,后期木質(zhì)素含量上升趨勢(shì)平緩。PgMYB表達(dá)與總木質(zhì)素含量呈負(fù)相關(guān)。

圖6　不同品種石榴種皮PgMYB的

圖7　不同發(fā)育時(shí)期石榴種皮PgMYB的

3討論

石榴果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富,其籽粒中含有豐富的維生素、煙酸、植物雌激素以及抗氧化物質(zhì)鞣酸等,具有多種醫(yī)療保健作用[22]。石榴籽粒有軟籽和硬籽之分,市場(chǎng)上較多的是鮮食硬籽品種,營(yíng)養(yǎng)可利用價(jià)值少,而軟籽石榴核軟可食,營(yíng)養(yǎng)充分利用,探討石榴軟籽性狀形成機(jī)理具有重要意義。本研究通過(guò)測(cè)定‘突尼斯軟籽’、‘會(huì)理軟籽’和‘紅玉石籽’的籽粒硬度和種皮總木質(zhì)素含量并分析兩者關(guān)系,發(fā)現(xiàn)石榴籽粒硬度與種皮中總木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān),種皮中的總木質(zhì)素是構(gòu)成籽粒硬度的一個(gè)重要組分,這為深入了解石榴軟籽性狀形成原因提供基礎(chǔ)。

木質(zhì)素生物合成主要受結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因兩類基因控制,由調(diào)節(jié)基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。MYB是植物中最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一,在不同物種中,MYB蛋白結(jié)構(gòu)和序列存在差異,甚至同一物種的MYB家族也存在多個(gè)分支[23],MYB高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榉蛛x和鑒別MYB家族成員提供了理論基礎(chǔ)[24]。本研究根據(jù)與木質(zhì)素合成相關(guān)的MYB基因保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,結(jié)合RACE技術(shù)從石榴中分離得到PgMYB基因,其推導(dǎo)的氨基酸N端具有2個(gè)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位顯示其定位于細(xì)胞核,符合轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位的特征。分析PgMYB蛋白與其他MYB蛋白的進(jìn)化關(guān)系發(fā)現(xiàn)其與桉樹(shù)的EgMYB1[25]和擬南芥的AtMYB32[26]進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較近,而這兩者被鑒定為在木質(zhì)素生物合成中起轉(zhuǎn)錄抑制作用,推測(cè)PgMYB是一個(gè)R2R3亞類轉(zhuǎn)錄因子基因,可能在石榴種皮木質(zhì)素生物合成過(guò)程中起抑制作用。

本研究通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)PgMYB在3個(gè)不同硬度石榴品種中的表達(dá)存在差異,籽粒硬度越小的品種,表達(dá)量越高,同時(shí)種皮總木質(zhì)素含量越低。對(duì)花后20、40、60、80、100和120 d的‘紅玉石籽’石榴種皮總木質(zhì)素含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在其不同發(fā)育時(shí)期中,木質(zhì)素含量持續(xù)上升,而PgMYB的表達(dá)水平隨著發(fā)育期的進(jìn)行逐漸下降,與總木質(zhì)素含量呈負(fù)相關(guān),推測(cè)PgMYB可能抑制石榴種皮木質(zhì)素的生物合成,這為深入了解和調(diào)控石榴軟籽性狀奠定了基礎(chǔ)。木質(zhì)素是影響石榴籽粒硬度的一個(gè)重要因子,由于木質(zhì)素生物合成途徑復(fù)雜,MYB蛋白作為植物中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子,其調(diào)控石榴種皮木質(zhì)素的生物合成途徑及其具體的作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究探討。

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(編輯:宋亞珍)

Clone and Expression of a Lignin Biosynthesis-related Transcription

Factor GenePgMYBin Pomegranate Seed Coat

CAO Danqin,YANG Jian,GUAN Xiaowan,ZHANG Yongjuan,GONG Lingyan,ZHANG Shuiming*

(College of Horticulture,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)

Abstract:To study the mechanism of pomegranate seed hardness,and the function of transcription factor genePgMYBin lignin biosynthesis pathway of pomegranate seed coat,we measured the seed hardness and total lignin content in different pomegranate cultivars.A novelMYBtranscription factor genePgMYBwas isolated from cultivar ‘Hongyushizi’ by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE).The expression levels ofPgMYBwere analyzed by real time-PCR.The results showed that:(1)The hardness of pomegranate seed and the total lignin content in seed coat were positively correlated with a correlation coefficient of 0.906.(2)The full-length cDNA ofPgMYBwas 1 088 bp with an open reading frame of 921 bp encoding a protein of 306 amino acid residues.It’s a typical R2R3-MYB transcription factor gene in plant with twoMYBDNA binding domains at its N-terminus.Blast X analysis showed thatPgMYBhad high identity withLeucaenaleucocephalaMYB1 andArabidopsisthalianaMYB4 as 89% and 84%,respectively.(3)Real time-PCR analysis indicated that the relative expression ofPgMYBwas negatively correlated with the hardness of pomegranate seed and total lignin content in seed coat.(4)At each stage of ‘Hongyushizi’ fruit development,the relative expression ofPgMYBwas always negatively correlated with the total lignin content in seed coat.It was speculated thatPgMYBmight repress the biosynthesis of lignin in pomegranate seed coat.The results expected to lay a foundation for study the mechanism of pomegranate seed hardness.

Key words:pomegranate;seed hardness;seed coat;lignin;PgMYBgene;expression analysis

中圖分類號(hào):Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡(jiǎn)介:曹丹琴(1990-),女,在讀碩士研究生,主要研究果樹(shù)種質(zhì)資源與生物技術(shù)育種。E-mail:15956998735@163.com*通信作者:張水明,博士,副教授,主要從事園藝植物種質(zhì)資源與生物技術(shù)育種研究。E-mail:zhangshm893@sohu.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(30900971)

收稿日期:2014-09-17;修改稿收到日期:2014-12-02

文章編號(hào):1000-4025(2015)01-0023-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2015.01.0023