拉枝處理對‘翠冠’梨成花的影響及其調控機制

李曉龍,王　超,李甲明,劉　倫,吳　俊

(南京農業大學 園藝學院,南京 210095)

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拉枝處理對‘翠冠’梨成花的影響及其調控機制

李曉龍,王超,李甲明,劉倫,吳俊*

(南京農業大學 園藝學院,南京 210095)

摘要:以‘翠冠’梨為研究材料,對枝條進行90°拉枝處理,探明拉枝對梨成花及其相關基因(LFY、TFL1和FT)的表達以及內源激素和營養物質含量的影響。結果表明:(1)90°拉枝處理能夠大幅度提高‘翠冠’梨的成花率。(2)與不拉枝處理相比,90°拉枝處理的花芽分化促進類激素——玉米素(ZT)和脫落酸(ABA)的含量上升,花芽分化抑制類激素——赤霉素(GA3)和生長素(IAA)的含量下降,可溶性糖含量和淀粉含量在花芽分化期間大量積累,全氮含量(N)下降,C/N比顯著提高,且成花促進基因(LFY和FT)的表達量上升,成花抑制基因(TFL1)的表達量下降。(3)相關分析顯示,LFY、FT基因表達量與ZT、ABA含量呈顯著正相關關系,與GA3、IAA含量呈顯著負相關關系,與可溶性糖含量、淀粉含量和C/N比呈顯著正相關關系,與全氮含量呈顯著負相關關系,而TFL1基因表達量與LFY、FT基因表達量呈顯著負相關關系。研究認為,拉枝處理通過提高成花過程中花芽分化促進類內源激素含量和營養物質含量,上調成花促進基因表達水平,以及這些指標間相互影響共同調控提高‘翠冠’梨成花率。

關鍵詞:梨;拉枝;基因表達;內源激素;營養物質

梨樹的頂端優勢十分明顯,萌芽率高,成枝力弱,因此枝條較為稀少,樹冠形成比較慢;而開張角度可以解除頂端優勢,促進梨樹的發枝,增加中短枝的組成,進而促進梨樹成花。目前關于木本科果樹開張角度方面的研究多集中在以下3個方面。一是拉枝調節幼樹生長。多點多品種調查蘋果密植園幼樹拉枝與普通修剪結果表明,采用拉枝的果樹較普通修剪樹冠大、枝量多、短枝率高、成花早、成形快[1];此外,梨幼樹拉枝能加大枝條角度,削弱頂端優勢,緩和生長勢,增加中短枝葉量,改善光合條件,有利于花芽形成,提早結果[2]。二是拉枝改變枝類組成。適度的拉枝能促進枇杷優良結果母枝的形成并使其花期集中[3]。三是拉枝影響果實品質。拉枝對蘋果果實品質影響的研究表明,除果實總酸含量外,果實單果重、花色素含量、硬度、總糖含量、維生素C(VC)含量以及蛋白質含量等多個指標均隨拉枝角度的增大而升高,并在拉枝110°時以上各組份含量達到最高,隨后下降[4-6]。綜合以上報道來看,這些研究重在解析拉枝生理效果,并未對拉枝促進成花的分子及調控機理進行深入探討。此外,有研究表明赤霉素家族中 GA3類在桃成花過程中起抑制作用,并且具有一定時期性;GA3處理抑制了成花關鍵基因PpLEAFY及MADS6正常表達[7]。在刺梨花芽分化的各個時期,花芽中的淀粉和水溶性總糖含量都明顯高于葉芽,而總氮含量卻是 葉芽高于花芽,其碳/氮比值顯著高于葉芽[8]。因此,本研究擬以砂梨主栽品種‘翠冠’為試材,考察拉枝處理對梨成花數量、成花相關基因表達、內源激素以及營養物質水平的影響,以期為解析拉枝促進梨樹成花的分子和調控機制以及生產實踐應用提供理論依據。

1材料和方法

1.1材料與處理

本試驗在南京農業大學江浦農場梨園進行,試驗材料以長勢良好、無病蟲害的5年生‘翠冠’梨樹為研究對象。試驗于2012年4月下旬進行,選取生長狀態、負載量大致相同的‘翠冠’梨樹10株,選粗細相同(直徑大約為2 cm)、長度相同的無分枝側枝進行拉枝處理,拉枝角度為90°,不拉枝的為對照。每個處理5株‘翠冠’梨樹,每株梨樹選取5個枝條進行拉枝。拉枝部位遵循方位一致和高度一致原則。分別于2012年5月20日(生理分化期)、6月20日(花芽開始分化期)、7月20日(花芽大量分化期)和8月20日(花器官原基分化期)取拉枝處理和對照組的飽滿頂芽,經液氮速凍后-80 ℃保存。并于2013年3月統計拉枝(處理組)和不拉枝(對照組)梨樹的成花率(花芽個數/總芽數)。

1.2花芽內源激素和營養物質含量的測定

花芽內源激素的提取參考曹尚銀等[9]的方法。實驗所用液相色譜儀型號為Waters 1525,用C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A泵用含0.6%冰乙酸的超純水色譜甲醇,B泵使用色譜甲醇,上機之前一定要排除氣泡,水相要進行抽濾排除雜質;進樣流速為1 mL/min,柱溫箱內的溫度保持在35 ℃,用Waters 2487紫外檢測器在540 nm波長處檢測;每次進樣量保持恒定的5 μL,最后用標準曲線計算其含量。標樣IAA、GA3、ABA和ZT均購自Sigma公司,色譜甲醇來源于Fisher Chemical公司。用蒽酮比色法[10]測定花芽內可溶性糖含量和淀粉含量,用凱式定氮法[11]測定總氮含量。

1.3花芽總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

采用改良的CTAB法[12]提取梨花芽的總RNA,用1%瓊脂糖膠檢測RNA質量,并利用核酸分析儀NanoDrop(Thermo)檢測其濃度,于-20 ℃保存備用。以1 μL總RNA為模板,利用接頭引物M13-20和dT(16)反轉錄合成cDNA第一鏈。10 μL合成體系為:2 μL 5×AMV緩沖液,4 μL dNTP(2.5 mmol/L),0.25 μL RNase inhabitor,0.5 μL Adaptor-dT(16),1 μL AMV和1 μg RNA;加RNase Free ddH2O至10 μL。放入PCR儀中,設定程序為:30 ℃ 10 min,42 ℃ 60 min,99 ℃ 5 min,4 ℃ 5 min。將其瞬時離心后,于-20 ℃保存備用。

1.4實時熒光定量PCR反應

按照Real Master Mix(SYBR Green)PCR試劑盒(購自寶生物工程有限公司)操作指導,采用iCycler iQ real-time PCR(Bio-Rad,美國)儀器進行實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)檢測成花相關基因LEAFY(LFY)、TERMINALFLOWER1(TFL1)和FLOWERINGLOCUST(FT)的時空表達特性。

20 μL RT-qPCR反應體系為:10 μL SYBR GreenReal-time Master Mix(TaKaRa,大連),1.5 μL的cDNA 模板,0.2 μmol/L的待測基因和內參基因的特異引物。擴增目標基因引物見表1,選擇EF1α(Accession No.AY338250)和TUB-b2(Accession No.AB239681)為內參基因。反應程序為:95 ℃預變性2 min,94 ℃變性15 s,60 ℃退火15 s和72 ℃延伸20 s,45個循環。每次反應均用ddH2O和未經反轉錄RNA樣品為模板,以相同的引物序列進行擴增,以檢測試劑和樣品中是否存在DNA污染。每個樣品分別進行3次生物學重復和3次技術重復。利用Bio-Rad IQ-5 Optical system Software軟件測定所得的數據,基因相對表達量分析采用2-ΔΔCt方法計算。

表1　熒光定量所用引物

1.5數據分析

用SPSS軟件進行方差分析和相關性分析。

2結果與分析

2.1拉枝對梨樹成花率的影響

拉枝處理組和對照組梨樹的成花率(花芽個數/總芽數)統計結果表明,處理組枝條的成花率為84%,而對照組的成花率只有17%。可見,梨樹拉枝處理可以顯著提高‘翠冠’梨樹的成花率。

2.2拉枝對梨花芽內源激素含量及其比值的影響

從圖1中可以看出,拉枝處理組和對照組花芽中的內源激素ZT和ABA的含量變化趨勢相同,而GA3和IAA的含量變化趨勢相同。其中,在梨樹生理分化期(5月20日),花芽和葉芽并未表現出不同,所以處理和對照內源激素含量均差異不顯著;但是在花芽分化過程中,處理和對照花芽內源激素含量出現差異,表現為ZT和ABA含量高于對照,而GA3和IAA含量低于對照,尤其是在花芽開始分化時(6月20日),處理和對照的差異最為明顯。

圖2顯示,花芽分化促進類激素ZT、ABA與抑制類激素GA3、IAA的比值,在花芽分化期拉枝處理組的比值始終大于對照組,且ZT/GA3、ZT/IAA、ABA/GA3和ABA/IAA變化趨勢一致。其中,處理組花芽各激素比值在花芽分化期顯著高于生理分化期,并在成花啟動后顯著下降。對照組的ZT/GA3和ABA/GA3在花芽大量分化之前(Ⅲ)比值都與生理分化期(Ⅰ)差異都不顯著,但在花器官原基形成的時期(Ⅵ)比值明顯下降;ZT/IAA和ABA/IAA在花芽開始分化(Ⅱ)和大量分化(Ⅲ)時含量顯著高于生理分化期,但是在花器官原基分化時期比值下降。這說明梨樹花芽分化需要較高的ZT/GA3、ZT/IAA、ABA/GA3和ABA/IAA,拉枝處理能明顯增加這些比值,從而促進花芽分化。

圖1　拉枝對梨花芽分化期各階段內源激素的影響

2.3拉枝對梨樹花芽內主要營養物質含量的影響

梨枝條處理組與對照組的花芽組織中可溶性糖含量在生理分化期沒有差異,之后在形態分化期二者產生差異,且處理組均大于對照(圖3,A)。其中,在花芽從生理分化期至形態分化期的過渡中,處理組和對照組的可溶性糖含量均急劇上升,但是處理組比對照組上升的速度更快;之后,處理組與對照組的可溶性糖含量均保持在花芽開始分化時期的水平。同時,梨枝條處理組與對照組中的淀粉含量在生理分化期沒有差異,之后的形態分化期二者產生差異,且處理組均高于對照組(圖3,B)。處理組和對照組花芽淀粉含量均隨發育時期呈逐漸上升趨勢,但成花轉變期間拉枝處理淀粉含量急劇上升,而對照組略有上升;它們在花芽大量分化期基本保持不變,但到花器官原基合成期間又略有緩慢上升。以上結果說明拉枝處理可以促進梨樹花芽可溶性糖和淀粉積累,尤其是在成花轉變時期效果更明顯。

2.4拉枝處理對梨樹花芽全氮含量的影響

如圖4,A所示,‘翠冠’梨拉枝處理組和對照組花芽中的全氮含量在生理分化期無顯著差異。對照組花芽的全氮含量在整個花芽發育期始終變化不顯著,而處理組在花芽分化期全氮含量先持續大幅下降,之后略有上升。花器官原基分化期花芽氮含量上升可能與此時新梢二次生長有關。這說明梨樹花芽分化需要低水平的總氮含量。

圖2　拉枝對花芽分化期各階段內源激素比值的影響

圖3　‘翠冠’梨花芽可溶性糖含量(A)和淀粉含量(B)的變化

圖4　‘翠冠’梨花芽全氮含量(A)和碳氮比(B)的變化

圖4,B表明,‘翠冠’梨處理組和對照組花芽的C/N在生理分化期也無顯著差異;在生理分化期至形態分化期的過渡過程中,處理組花芽的C/N急劇上升,直至花芽大量分化期達到峰值,之后略下降,而對照組花芽C/N在花芽開始分化時略有上升,并在之后的形態分化期沒有明顯變化。這說明梨樹花芽形態分化期需要高的C/N。

2.5拉枝對梨樹成花相關基因LFY、TFL1和FT表達的影響

拉枝處理和對照組LFY基因的表達量在梨樹花芽生理分化期差異不顯著,但在整個花芽分化期拉枝處理顯著遠高于對照(圖5,A)。其中,在花芽開始分化期,拉枝處理的LFY基因表達量驟升,但與花芽大量分化期LFY基因的表達量差異不顯著,而這兩個時期均明顯高于花器官原基分化期。同時,在花芽開始分化期至花器官原基分化期,對照組LFY表達量的變化趨勢與拉枝處理相同,但是LFY基因的表達量一直都很低。這說明梨花芽分化和花器官原基分化都需要高水平的LFY基因表達。

同期拉枝處理和對照梨樹TFL1基因表達的變化趨勢是一致的,即生理分化期TFL1基因的表達量最高,在花芽開始分化期驟然減少,之后一直維持下降趨勢,并在器官原基分化期表達量最低。拉枝處理和對照雖然在生理分化期TFL1的表達量相同,但是在花芽分化期拉枝處理的TFL1基因表達量明顯低于對照(圖5,B)。

另外,梨樹花芽生理分化期拉枝處理和對照FT基因的表達量差異也不顯著,但是在整個花芽分化期拉枝處理的FT基因表達量要明顯高于對照(圖5,C)。拉枝處理梨樹枝條FT基因的表達量在花芽開始分化期驟升,之后表達量下降,但是仍然始終維持高水平表達。而對照FT基因在花芽開始分化和大量分化時表達量較生理分化期驟降,且表達量極低,雖然到花器官原基分化期略有升高,但是其表達量依然明顯低于同期拉枝處理。

圖5　拉枝處理對LFY、TFL1和FT基因表達的影響

以上結果說明,拉枝處理使成花促進基因LFY和FT的表達量上升,成花抑制基因TFL1的表達量下降,從而從分子水平解釋了拉枝促進梨樹成花的內在機理。

2.6拉枝梨樹花芽成花各因素間的相關分析

影響梨樹成花的因素間的相關性分析結果如表2所示。首先,在拉枝梨樹花芽分化過程中,基因LFY表達量與FT表達量呈正相關,FT和LFY表達量與TFL1表達量呈負相關,說明FT和LFY基因共同作用促進梨樹成花,而TFL1則抑制成花。

其次,花芽內源激素ZT含量與GA3含量呈顯著負相關,與IAA含量呈極顯著負相關,而與ABA含量呈不顯著正相關;GA3含量與IAA含量呈極顯著正相關,與ABA含量呈不顯著負相關;IAA含量與ABA含量呈不顯著負相關。可見,ZT和ABA是花芽分化促進類激素,GA3和IAA是花芽分化抑制類激素,并且GA3和IAA在花芽分化后期含量上升,促進枝條生長;花芽分化過程中內源激素之間有相互促進和相互制約的關系,即花芽分化促進類激素ZT和ABA、花芽分化抑制類激素GA3和IAA,同類激素之間有相互促進的作用,異類激素有相互抑制的作用。

再次,梨花芽分化過程中的花芽可溶性糖含量與淀粉含量呈顯著正相關,而與氮含量呈顯著負相關,淀粉含量和氮含量呈顯著負相關。這說明花芽分化需要營養物質的配合,可溶性糖和淀粉作為花芽分化的營養物質,而高含量的氮有促進生長的作用,所以只有這種生長作用的減緩或停止,才有利于花芽分化。

另外,內源激素ZT含量和LFY基因表達量與營養物質可溶性糖含量和淀粉含量呈顯著正相關;GA3和IAA含量與TFL1基因表達量呈顯著負相關,與營養物質可溶性糖含量呈極顯著負相關,而與淀粉呈顯著負相關;TFL1基因表達與可溶性糖含量呈顯著負相關,與淀粉含量呈極顯著負相關,而與氮含量呈顯著正相關。因此,成花相關基因、內源激素和營養物質對花芽分化的影響并不是孤立存在的,它們內部之間互相影響,各個因素之間也互相影響,促進類因子共同促進,抑制類因子共同抑制,通過此消彼長的調節來達到調控成花的目的。

3討論

‘翠冠’梨是南方地區梨的主栽品種。從經濟角度考慮,近年來水果生產成本和市場價格的比率開始增長,減少生產成本、提高產出對于果園管理十分重要,因此控制果樹營養分配顯得越來越重要。在傳統的果園管理和農業生產實踐中,拉枝處理已經被證明是控制生長,促進生殖生長和結果的最有效方法。拉枝處理在果園的生產實踐中得到廣泛應用,已被整合到Solaxe培訓系統中[13]。以往研究表明拉枝使‘翠冠’形成了良好的冠形[14]。此外,在相同拉枝時間內水平拉枝和下垂拉枝抽生的中短枝比例最高,在相同拉枝角度下拉枝時間越晚抽生的中短枝比例越低[15]。富士蘋果拉枝角度為110°時,樹體成花率最高,果實品質方面的相關指標也最優[4]。結合梨樹萌芽率和成枝力低的特點,110°拉枝處理容易造成樹體早衰,因此本研究中對‘翠冠’梨的拉枝處理角度選擇90°,拉枝時間選在4月份。

研究表明,隨著拉枝角度的增大,‘嘎啦’蘋果頂芽的可溶性糖含量和淀粉含量增加,氮含量減少,C/N增大[16],本實驗的研究結果與之一致,說明拉枝處理通過改變花芽中營養成分的含量來達到控制成花的目的。此外,‘富士’蘋果頂芽的N含量在生理分化期明顯高于形態分化期,可溶性糖含量和淀粉含量在花芽分化期含量最高[17],本實驗結果與其結論一致,這說明花芽分化需要大量的營養物質。

拉枝促進花芽分化是通過改變花芽內激素的平衡來達到目的。在花芽從生理分化向形態分化期過渡期間對暗柳橙去葉摘花,結果表明去葉明顯減少了ZR的上升,減少了花芽的形成[18]。此外,拉枝能夠打破頂端優勢,影響激素的分布變化規律,生長促進類激素GA和IAA含量降低,生長抑制類激素ABA和ZT含量升高,從而促進花芽分化,平衡營養生長和生殖生長[19-20]。本研究表明拉枝對‘翠冠’梨花芽內源激素的影響規律與以往報道相一致。

Luckwill等認為激素的平衡變化可以導致成花相關基因解除阻遏[21]。Corbesier等[22]認為果樹不能開花是由于成花相關基因處于封閉狀態或基因處于開啟狀態,但卻無法完成轉錄或在轉錄后的翻譯過程中受阻。

開花歸根結底是要啟動成花相關基因,激素和營養物質對基因的開啟有何作用是關鍵。生長素的基因表達學說認為:生長素可以使細胞伸長所需的一些基因脫阻遏,從而使其得到表達。有研究表明,生長素誘導的原初基因在10min之內就可以檢測到mRNA濃度的增加。在無外源生長素的情況下,原初基因在根、子房和發育的種子中有一定的表達,而在其它器官不表達。當在外界其他條件不變的情況下對植物施用外源生長素后,幾乎所有器官中原初基因都有很高的表達,這說明基因表達的限制因子是生長素濃度不夠高[23]。GA對α-淀粉酶合成的作用位置是在盾片和糊粉層,外施GA于大麥種子后一段時間就能檢測出α-淀粉酶,而去除GA后α-淀粉酶合成的速率就下降,若再加入GA則合成速率又立即增快。進一步研究表明,α-淀粉酶基因在GA的調控下進行轉錄生成mRNA前體,經過加工修飾成為活化的mRNA,mRNA翻譯成前體酶再加工成為活化的酶[24]。另外,組蛋白可以對基因的表達起到限制的作用,從而影響到基因的轉錄。以上證據都表明,植物激素可以通過調控轉錄和翻譯過程從而調控蛋白質合成和酶活性,最終達到調控果樹花芽分化的目的。花芽分化除了需要基因啟動和激素調控外,外部條件也應具備。成花相關基因啟動后,外界需要提供充足的營養物質,否則成花也會失敗。這也是花芽分化需要營養生長和生殖生長的平衡、合適的C/N、高含量的淀粉儲備的原因。

綜上所述,本研究對‘翠冠’梨樹進行拉枝處理后,花芽分化促進類激素ZT和ABA的含量上升,花芽分化抑制類激素GA3和IAA含量下降;可溶性糖含量和淀粉含量在花芽分化期上升;成花促進基因LFY和FT的表達量上升,成花抑制基因TFL1的表達量下降。同時,對內源激素、營養物質和成花相關基因表達三者進行相關性分析,結果也表明三者之間有顯著相關性,在調控花芽分化的過程中相互影響。從而解釋清楚了拉枝處理提高‘翠冠’梨成花率的內在調控機理,為拉枝提高梨的成花率提供了科學依據。

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(編輯:裴阿衛)

Effect and Regulation Mechanism of Branch-drooping

on Flower Bud Formation of Cuiguan Pear

LI Xiaolong,WANG Chao,LI Jiaming,LIU Lun,WU Jun*

(College of Horticulture,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

Abstract:The cultivar of ‘Cuiguan’ was selected as material to study the effects of branch-drooping on the flower bud formation,the expression of blossoming related genesLFT,TFL1 andFT,and the content of endogenous hormones and nutrients.Results showed that:(1)90° branch-drooping treatment significantly increased the flower bud formation rate of ‘Cuiguan’ pear by a large margin.(2)After the treatment of branch-dropping,the expression of flowering promoting genesLFTandFTincreased,while the expression of flowering suppressor geneTFL1 decreased.The contents of flower bud differentiation promoting hormones ZT and ABA increased,while the contents of inhibiting hormones GA3and IAA decreased.The ratio of C/N improved observably,while the content of nitrogen(N) descended.At the same time,the contents of soluble sugar and starch showed a large accumulation during flower bud differentiation.(3)Correlation analysis showed thatLFYandFTgene expression had a positive correlation with the contents of ZT and ABA,soluble sugar,starch,and the ratio of C/N.And it had a negative correlation with the contents of GA3,IAA,N,andTFL1 gene expression.This study suggested that branch-drooping treatment increased flowering promoting gene expression level by increasing flower bud differentiation promoting class endogenous hormone contents and nutrient contents during the process of flower bud formation,as well as interactions between these indicators together to improve ‘Cuiguan’ pear flower rate.

Key words:pear;branch-drooping;gene expression;endogenous hormones;nutrition

中圖分類號:Q945.6;Q789

文獻標志碼:A

作者簡介:李曉龍(1989-),男,在讀碩士研究生,主要從事果樹學研究。E-mail:2013104021@njau.edu.cn*通信作者:吳俊,教授,博士生導師,主要從事果樹分子育種研究。E-mail:wujun@njau.edu.cn

基金項目:江蘇省科技支撐項目(BE2011320);教育部新世紀人才項目(NCET-13-0864);國家梨產業技術體系(CARS-29)

收稿日期:2014-09-16;修改稿收到日期:2014-12-15

文章編號:1000-4025(2015)01-0089-09

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2015.01.0089