小檗堿對糖尿病大鼠胃壁神經元及腸系膜和心臟微血管損傷的保護作用*

祁艷艷 郝璋森 梁紅玉 張思博 趙 丁，2，#

小檗堿對糖尿病大鼠胃壁神經元及腸系膜和心臟微血管損傷的保護作用*

祁艷艷1郝璋森1梁紅玉1張思博1趙 丁1，2，#

目的：觀察小檗堿對早期糖尿病大鼠胃腸神經元、腸系膜和心臟微血管損傷的改善作用。方法：清潔級SD 大鼠15 只，采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，65mg/kg)制備糖尿病模型，12 只成模大鼠隨機分為模型組(n=6)和小檗堿組(n=6)。成模2 周后小檗堿組以小檗堿溶液(200mg/kg)灌胃2周，模型組灌胃等量雙蒸水。同批次普通飼料喂養的大鼠作為對照組(n=6)。給藥2 周后觀察各組大鼠毛色、體重和血糖，并取各組大鼠胃壁、腸系膜和心臟制備組織病理切片。通過甲苯胺藍-伊紅染色觀察其胃體、胃底黏膜下神經元尼氏體數量及腸系膜微血管和心肌微血管的組織病理學變化，比較各組各指標的差異。結果：實驗28天后，與對照組大鼠相比，模型組大鼠飲水、排尿量增加，毛色暗啞，尾部變黑，體重較對照組明顯降低，血糖水平較對照組明顯升高(P均<0.01)。小檗堿組較模型組大鼠毛色有光澤，尾部黑色現象有所減退，但體重及血糖水平改善均不明顯(P均>0.05)。模型組大鼠胃體、胃底黏膜下神元尼氏體數量較對照組減少甚至消失，腸系膜微血管皺縮且瘀血嚴重，心肌微血管肌層變薄。小檗堿組胃壁神經叢尼氏體數量較模型組增多，腸系膜微血管變形、瘀血及心肌微血管情況均較模型組有所改善。結論：小檗堿對早期糖尿病大鼠胃壁神經及腸系膜和心臟微血管損傷有一定保護作用。

小檗堿；糖尿病；胃壁神經叢；尼氏體；微血管；大鼠

糖尿病外周神經和血管病變是其常見并發癥。糖尿病患者的胃腸神經受損引起胃腸功能紊亂[1]，而微血管病變又與神經病變密切相關，其發病機制與防治一直是近年來糖尿病研究的熱點[2]。

研究表明，中藥黃連的有效成分小檗堿具有降糖、降脂，抗氧化、抗心衰、抗腫瘤等作用[3，4]。并對阿爾茨海默癥及缺血等引起的神經元損傷具有保護作用[5]。但小檗堿對糖尿病胃腸神經病變及血管損傷作用報道甚少。本文旨在前期研究[6]的基礎上，進一步觀察小檗堿對糖尿病大鼠胃壁神經元、腸系膜及心臟微血管病變的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物和儀器

小檗堿(四川協力制藥有限公司，批號：061002)LEICA RM 2135 切片機(德國)；血糖儀，美國雅培制藥有限公司；血糖試紙，美國Abbott Diabetes Care INC。鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ) ，ALEXIS Biochemicals 公司；甲苯胺藍(M=305.8)、伊紅(M=647.49)，北京化工廠；苦味酸(M=229.11)，上海化學試劑有限公司。小檗堿溶液的配制：以重蒸水為溶劑，配制成50mg/ml 的小檗堿溶液[7]。自制營養液：用雙蒸水配制改良Krebs-Henseleit(K-H)液[8]，作為組織沖洗液，實驗當天配制和使用。自制組織固定液：飽和苦味酸溶液、10%甲醛、冰乙酸按15∶5∶1 的比例配制，現配現用。

1.2 實驗動物和分組處理

清潔級SD 大鼠21 只，雄性，體重200±20g，由河北醫科大學動物實驗學部提供(許可證號：SCXK(冀)2013-2-001)；適應性喂養5-7 天；飼養環境符合GB14925-2010 要求，動物自由飲水和進食。飼料由河北醫科大學動物實驗學部提供，飲用水為無菌過濾水。

采用隨機數字表法分為三組，6 只作為空白對照組。其余15只禁食12h后，腹腔注射1%STZ(65mg/kg 體重)[9]，72h后尾靜脈采血，測定隨機血糖(葡萄糖氧化酶法)；血糖值≥16.7mmol/L時，即認為制模成功[10 ]。共12 只大鼠成模。2 周后隨機分為模型組(n=6)、小檗堿組(n=6)；小檗堿組以200mg/kg 體重的小檗堿溶液灌胃[11，12]，模型組以等量雙蒸水灌胃，1 次/日，連續2周。實驗期間各組大鼠均以普通飼料喂養。

1.3 大鼠大體觀、體重和血糖測定

實驗前和實驗四周后觀察各組大鼠毛色、飲水及排尿情況，并測定各組大鼠實驗前后的體重及血糖水平。

1.4 組織病理學觀察

1.4.1 樣本采集與制片：大鼠斷頭處死后即刻開腹摘取胃底、胃體、腸系膜以及心臟，4℃營養液沖洗，心臟切取心尖部分。將所取組織于新鮮固定液中固定24h 以上(胃底及胃體固定時用蠟塊釘平，防止標本過度皺縮)。將固定好的標本經梯度酒精脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，切片(5μm)。

1.4.2 染色： 組織切片經二甲苯→ 無水乙醇→ 95%酒精→浸入蒸餾水過洗(1min)；浸入0.25%甲苯胺藍溶液中，室溫下染色30s；再經蒸餾水過洗→95%乙醇分化→0.25%伊紅醇溶液復染3s→100%乙醇→二甲苯透明；中性樹脂膠封片。

1.4.3 顯微鏡觀察：于光鏡下觀察各組大鼠胃體和胃底粘膜下神經元尼氏體數量和形態以及腸系膜微血管、心臟微血管的改變。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 體重及血糖水平變化

實驗前，三組大鼠體重和血糖差異無統計學意義(χ2=1.689、0.779，P>0.05)，大體觀相近。實驗28天后，三組大鼠體重和血糖差異均有統計學意義(F=12.81、43.61，P<0.05)；與對照組比較，模型組大鼠飲水、排尿增多，毛色暗啞，尾部變黑，體重明顯降低(P<0.01)，血糖水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，小檗堿組大鼠飲水和排尿幾無差別，毛色變得有光澤，尾部變黑現象有所改善，但體重及血糖水平改善不明顯(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體重和血糖值變化均=6)

注：與同期對照組比較，1)P<0.05；2)P<0.01

2.2 各組大鼠胃壁神經元尼氏體分布

神經元尼氏體經甲苯胺藍-伊紅染色后呈深藍色。對照組胃底、胃體黏膜下神經元尼氏體清晰可見，數量較多，靠近細胞核者呈斑塊狀，邊緣處細長；與對照組比較，模型組尼氏體溶解變形，數量減少，甚至消失；小檗堿組尼氏體數量較對照組少，但多于模型組，有一定程度的溶解變形(圖1、圖2)。

2.3 各組大鼠腸系膜微血管變化

肉眼觀察，與對照組比較，模型組大鼠腸系膜血管皺縮、瘀血嚴重；小檗堿組血管皺縮、瘀血情況較模型組有所改善。光鏡下，與對照組比較，模型組大鼠腸系膜微動脈平滑肌分層混亂，著色不均；小檗堿組腸系膜微動脈平滑肌分層較清晰，著色相對均勻(圖3、圖4)。

2.4 心臟微血管變化

與對照組比較，模型組大鼠心肌微血管肌層變薄，不著色甚至消失，心肌細胞間出現裂隙，小檗堿組較模型組血管肌層厚，且心肌細胞間裂隙也較模型組少(圖5)。

[本文圖1-圖5見封2和插1反面]

3 討 論

糖尿病外周神經病變主要由長期高血糖誘發神經缺血缺氧造成，這種神經損害發展到糖尿病晚期將不可逆轉，主要表現在導致胃腸功能異常[13]。本研究采用STZ成功復制早期糖尿病大鼠模型[14]，大體觀，模型大鼠毛色暗啞，尾部變黑，精神狀態不佳；組織病理學觀察可見模型大鼠胃壁神經元尼氏體溶解變形，數量減少，甚至消失；腸系膜微血管變形、瘀血、平滑肌分層混亂；心肌微血管亦變形，微動脈肌層變薄。表明早期糖尿病大鼠胃部神經系統、腸系膜血管及心臟微血管均出現病變。經小檗堿灌胃給藥兩周后，實驗大鼠毛色變得有光澤，尾部變黑現象有所改善，胃壁神經元尼氏體數量增多，腸系膜微血管變形瘀血、平滑肌分層均有改善，心臟微血管肌層增厚，心肌細胞間裂隙減少。提示小檗堿對胃部神經元、腸系膜及心臟微血管損傷均有一定的保護作用。

曾有研究[12]報道，糖尿病大鼠經小檗堿灌胃給藥8周后，神經病理性疼痛癥狀減輕，外周神經的結構和功能得以維持。本課題組先期也曾報道過小檗堿體外給藥對早期糖尿病大鼠膀胱逼尿肌神經遞質釋放異常有明顯改善作用[14]。本研究結果又證實，小檗堿對糖尿病大鼠胃腸神經及血管損傷有一定保護作用，進一步豐富了這一研究的內容和資料。小檗堿發揮此等作用的機制可能與其降低血糖、調節神經功能、修復損害微血管等作用相關，但其分子機制有待進一步研究。

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本文第一作者簡介：

祁艷艷(1991-)，女，漢族，2010級本科生參考文獻

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3 沈 寧，李彩娜，環 奕，等. 小檗堿調節血糖血脂代謝紊亂機制研究進展[J]. 藥學學報，2010，45 (6): 699-704.

4 Yao J，Kong W，Jiang J. Learning from berberine: Treating chronic diseases through multiple targets[J]. Sci China Life Sci，2013，57: 1-6.

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14 Ren LM，Zhuo YJ，Hao ZS，et al. Berberine improves neurogenic contractile response of bladder detrusor muscle in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Journal of Ethnopharmacology，2013，150(3):1 128-1 136.

Berberine Improve the Pathological Damages of Gastric Nerve Plexus, Mesenteric and Cardiac Blood Vessels in Diabetic Rats

QI Yan-yan1,HAO Zhang-sen1, LIANG Hong-Yu1,ZHANG Si-bo1, ZHAO Ding1，2，#

1School of Pharmacy, Institute of Integrated Traditional and Western Medicine, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China；2State Key Laboratory of Bioactive Substance andFunction of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of MedicalSciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China；#Corresponding author

Objective: To investigate the effects of berberine on the pathological damages of gastric nerve plexus, cardiac and mesenteric blood vessels in the early diabetic rats.Method: 15 SD rats were injected streptozotocin (STZ 65mg/kg), 12 rats were divided into two groups randomly, one group was model group (n=6), another group was treated with berberine (n=6). After two weeks of the diabetic model was successfully made, berberine solvent was administrated by gavage for two weeks, and same amount of double-distilled water was given a gavage to the rats in model group simultaneously. The same batch of rats fed a normal diet as control group (n=6). After two weeks of treated with berberine, the colour of fur, investigated body weight and blood glucose of all rats were observed. And then tissues were taken, paraffin sections were made. The number of neuron nissl bodies which from the submucosal neurons of gastric body and fundus, and the cardiac and vascular pathological changes were deteated by the method of tolyidine blue and eosin dye.Results: Compared with the control rats, the hair and tail color were much darker, body weight was reduced (P<0.01), and the level of blood glucose was increased significantly (P<0.01) in the diabetic rats. There were no apparently differences in the body weight (P>0.05) and the level of blood glucose (P>0.05) between barbering administrated and diabetic rats, but for berberine group, the dark color of tail were dropped down and the hair were more luster. In the diabetic rats, the number of neuron nissl bodies in nerve plexus of gastric body and fundus were decreased or disappeared, while the cardiac and mesenteric blood vessels emerged obvious morphological changes and blood stasis. And in berberine treated rats, the populations of neuron nissl bodies were increased, the morphological changes and blood stasis were ameliorated. Conclusion: Berberine ameliorates the damage of gastric nerve, cardiac and mesenteric vascular in early diabetic rats.

Berberine; Diabetic; Gastric nerve plexus; Nissl bodies; Capillaries; Rat

河北省自然科學基金石藥基金項目(C2011206175);河北省科技廳科技支撐計劃項目(142777114D)

1河北醫科大學藥學院，河北醫科大學中西醫結合研究所，石家莊 050017；2中國醫學科學院/北京協和醫學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050；#

，E-mail: zhaodingd@163.com

本文2014-11-18收到，2015-01-18修回

R96

A

1005-1740(2015)02-0005-04