人血小板裂解液促進人羊膜來源間充質干細胞的成骨分化

董 晶 聶李平 周 宇

人血小板裂解液促進人羊膜來源間充質干細胞的成骨分化

董 晶 聶李平 周 宇

目的：研究人血小板裂解液(HPL)對羊膜來源間充質干細胞(AMMSCs)成骨分化的作用。方法：分別以含7% HPL(HPL組)和10%胎牛血清(FBS，FBS組)的LG-DMEM培養介質擴增AMMSCs，比較兩組擴增AMMSCs效率及其免疫表型SSEA-3和SSEA-4的表達差異。使用MSCs成骨分化培養液誘導AMMSCs成骨，對比觀察兩組鈣鹽沉積量、鈣化結節、堿性磷酸酶(ALP)活性；提取兩組成骨誘導后AMMSCs總RNA，采用RT-PCR檢測成骨分化調節因子RUNX-2和ALP mRNA相對表達量。結果：HPL組擴增速度快于FBS組；AMMSCs的 SSEA-3和SSEA-4表達較FBS組明顯下調(P<0.05)。HPL組鈣鹽沉積量、鈣化結節數量、ALP活性以及RUNX-2和ALP mRNA表達量均明顯高于FBS組(P均<0.05)。結論：含HPL培養介質可促進AMMSCs成骨分化。

人血小板裂解液；間充質干細胞；羊膜來源；成骨分化

研究表明，羊膜來源間充質干細胞(Amniotic Membrane-derived Mesenchymal Stem Cells, AMMSCs)的免疫表型與骨髓來源間充質干細胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells, BMMSCs)相似，具有多向分化能力，并且比BMMSCs有更強的擴增能力[1,2]。羊膜來源廣泛，受社會倫理學限制少，是MSCs來源的重要研究目標。血小板富含的各種生長因子能促進MSCs增殖，加速種植體周圍骨再生和修補骨缺損[3]。本實驗觀察含人血小板裂解液(Human Platelet Lysate, HPL)培養液擴增AMMSCs并誘導其成骨分化，探討HPL對AMMSCs成骨分化的影響，分析該方式的優勢，為利用AMMSCs進行骨缺損治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

流式細胞儀(XL-4，Beckman，美國)，全自動生化儀(AU-5400，Olympus，日本)，基因擴增儀(ABI-7500，Gene，美國)，胎牛血清(FBS，Gibco，美國，635742)，LG-DMEM (Hyclone，美國，NXH0681)，0.25% Trypsin (Hyclone，美國，NWD0400)。堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒(Beckman，美國，AUZ1780)，Ca2+濃度檢測試劑盒(Beckman，美國，AUX2129)，細胞裂解液Triton X-100 (Roche，瑞士) ，胚胎干細胞標志物鼠抗人單克隆抗體SSEA-4-PE、 SSEA-3-Alexa Fluor 488及同型對照均為美國BioLegend公司產品，MSCs成骨分化誘導培養液、茜素紅S均購自美國Cyagen公司。

1.2 AMMSCs的分離、擴增和成骨誘導分化

1.2.1 細胞培養液的制備及AMMSCs分離與擴增： 參照作者前期方法[2]，制備含FBS或HPL的細胞培養液，根據文獻[1]通過兩步酶消化法分離人羊膜組織收獲AMMSCs，將AMMSCs分別加入含FBS(FBS組)或HPL(HPL組)細胞培養液中并接種于培養皿，在37℃、5% CO2培養箱中培養，每3天換液1次。當細胞生長至80%-90%融合時，以0.25% Trypsin消化傳代。

1.2.2 AMMSCs的成骨誘導分化：當第3代AMMSCs生長至80%-90%融合時，以0.25% Trypsin消化，中和胰酶后150g離心10min，按3 × 103/cm2接種于預先以明膠包被的6孔板，分別加入含FBS或HPL的培養液至2ml。置于37℃，5% CO2培養箱中培養24h后，吸出培養液。再各加入2ml MSCs成骨分化培養液培養。每3天換液一次，共14天。

1.3 AMMSCs的擴增速度和免疫表型鑒定

從原代培養48h開始觀察，比較兩組培養達到80%-90%融合時所需的時間。待第3代AMMSCs達80%-90%融合時，制成1.0×109/ L的細胞懸液，分別加入熒光標記抗體SSEA-4-PE、SSEA-3-Alexa Fluor 488及其陰性對照單抗，室溫反應30min，再用PBS洗滌并重懸細胞。用流式細胞儀檢測。

1.4 成骨指標的檢測

1.4.1 鈣鹽沉積量測定：成骨誘導7天、14天后PBS洗滌培養板內細胞層，加入1mol/L HCl 2ml，充分振蕩后密封置于4℃冰箱保存過夜，使沉積在胞外的鈣基質充分溶解，24h后以1 500g離心10min，用Ca2+試劑盒在自動生化儀上測定上清液中的Ca2+濃度。

1.4.2 鈣化結節染色：成骨誘導培養14天后PBS洗滌培養板內細胞層，4%甲醛固定30min，再次使用PBS洗滌細胞2次后，0.1%茜素紅S染色3-5min，去離子水沖洗，鈣化結節被染成紅色。HPL組和FBS組各取3個培養孔，顯微鏡下每孔隨機選3個視野(×100)，計數鈣結節數量，取9個視野均數進行統計學分析。

1.4.3 ALP活性測定：成骨誘導7天、14天PBS洗滌培養板內細胞層后，每孔加入3ml 細胞裂解液(1%Triton X-100)置于4℃冰箱內保存，12h后吹打使細胞充分破碎，1 500g離心5min，采用全自動生化儀測定上清液中ALP活性。

1.4.4 成骨相關基因RUNX-2及ALP mRNA檢測：成骨誘導第7天、14天按常規方法提取AMMSCs總RNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測無降解后，取1μg總RNA反轉錄為cDNA作為模板，采用反轉錄聚合酶鏈反應檢測RUNX-2 mRNA和ALP mRNA表達，擴增體系及反應條件均參照說明書設定。β-actin為內參，所用引物序列如表1。以目的基因與β-actin mRNA比值表示目的基因表達量。

表1 RT-PCR的引物序列

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 AMMSCs的生長速度和形態

AMMSCs原代培養48h后，可觀察到貼壁生長的長梭形成纖維細胞樣細胞小克隆形成，HPL組7-10天即可達到80%-90%融合，FBS組則需10-14天。傳代后細胞呈渦旋狀或平行生長(圖1)。

2.2 兩組AMMSCs免疫表型陽性率

流式細胞儀檢測結果顯示，部分AMMSCs表達胚胎干細胞標志SSEA-4和SSEA-3，HPL組AMMSCs的SSEA-4和SSEA-3陽性率顯著低于FBS組(t值分別為3.843和4.608，P均<0.05)，見圖2和表2。

注：A，FBS組；B，HPL組圖2 FBS組和HPL組第3代AMMSCs的SSEA-3和SSEA-4表達流式圖

表2 兩組AMMSCs的SSEA-3和SSEA-4陽性率均=5)

注：與FBS組比較，1)P<0.05

2.3 兩組鈣鹽沉積量

AMMSCs成骨分化后第7天和第14天，HPL組的Ca2+總量均高于FBS組(表3)。差異有統計學意義(t值分別為9.439和17.750，P均<0.05)。

表3 兩組Ca2+總量均=5)

注：與FBS組比較，1)P<0.05

2.4 兩組鈣化結節形成及其數量

HPL組AMMSCs成骨誘導培養2天后，細胞開始變短，外形由長梭形向多邊形轉變，培養7 天后細胞基質中即有鈣沉積，培養14天時形成鈣化結節。茜素紅S染色顯示HPL組鈣化結節數量多于FBS組，且大而密集(圖3)。計數分析結果表明兩組差異有統計學意義( 22.90±6.20 vs 10.80±3.30，t=12.389，P<0.05)。

2.5 兩組ALP活性

AMMSCs成骨分化后第7天和第14天，HPL組ALP活性均明顯高于FBS組(表4)，差異有統計學意義(t值分別為13.035和11.231，P均<0.05)。

表4 兩組ALP活性均=5)

注：與FBS組比較，1)P<0.05

2.6 兩組成骨相關基因表達

PCR結果顯示，成骨誘導第7天和第14天，HPL組的成骨分化特異性基因RUNX-2 mRNA和ALP mRNA的相對表達量均高于FBS組，差異有統計學意義(圖4)。

[本文圖1、圖3見封3]

3 討 論

MSCs具有多向分化潛能、低免疫原性和修復作用，這些特點使其在再生醫學中有良好利用價值[4,5]。胎盤組織富含干細胞[6]，足月羊膜是MSCs的高通量來源[1]，對其研究不涉及倫理道德問題。HPL富含促進MSCs增殖的血小板衍生生長因子(Platelet-derived Growth Factor，PDGF)、成纖維細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor，bFGF)、轉化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)等生長因子[7],成為擴增臨床應用規模MSCs最合適的人源化FBS替代品[8], 是目前骨組織工程學領域有關種子細胞的成骨分化能力和體外擴增能力研究的有益嘗試。本文研究HPL對AMMSCs的擴增和成骨分化能力，為AMMSCs在臨床骨組織工程學上的應用提供實驗室依據。

SSEA-3和SSEA-4為胚胎干細胞的標志，在分化后的干細胞中不能被檢測到[9]。本文結果中，HPL介質擴增的AMMSCs的SSEA-3和SSEA-4表達陽性率顯著低于FBS介質擴增的AMMSCs，說明HPL更能促進AMMSCs的分化，而FBS介質擴增的AMMSCs處于更原始狀態。與有關文獻[10]認為HPL富含的TGF-β、PDGF能促進MSCs生長，同時也能誘導MSCs分化的結論一致。而且HPL中所含bFGF這一能支持未分化人胚胎干細胞生長的物質含量相對很低[11]，故而不會影響HPL對MSCs的分化[6-8]。

注：與FBS組第7天比較，*P<0.05;與FBS組第14天比較，#P<0.05圖4 兩組成骨相關基因RUNX-2 mRNA和ALP mRNA相對表達量(n均=6)

ALP能使磷酸根離子濃度增加而啟動細胞鈣化，尤其在鈣鹽沉積中起關鍵作用,其活性升高是成骨分化的特異性標志之一。本實驗成骨分化第7天和第14天，HPL組ALP活性和Ca2+總量較FBS組均明顯增高，PCR結果提示HPL組ALP mRNA明顯增多，表明HPL組的AMMSCs成骨分化程度較高。鈣鹽是骨骼的重要組成部分，茜素紅S染色顯示HPL組的鈣化結節較FBS組數量多且大而密集，進一步說明HPL能促進成骨過程中鈣鹽的沉積。

成骨分化過程經多能干細胞定向分化為前成骨細胞、幼稚的成骨細胞直至成熟的成骨細胞。RUNX-2是成骨分化過程的重要監控因子，從成骨分化的啟動階段即開始參與成骨分化的調控，通過上調I型膠原蛋白、骨橋蛋白、骨分泌蛋白和骨鈣蛋白等多種骨基質蛋白基因，引導多能干細胞向非成熟成骨細胞分化，對骨組織的形成起著重要作用[12]。本文結果表明，HPL組AMMSCs的RUNX-2 mRNA表達水平明顯高于FBS組，亦即HPL培養介質能更好促進AMMSCs的成骨分化。與HPL能增強BMMSCs成骨分化基因、ALP表達、礦物質沉積、增強體外成骨分化和體內異位骨形成的研究報道相符合[13,14]，也與醫學上應用富血小板血漿促進骨折愈合的臨床實踐相符合。

綜上所述，含HPL的培養介質能快速擴增AMMSCs，并能促進AMMSCs成骨分化，為骨組織工程研究及臨床上促進骨折愈合提供了一種新的AMMSCs擴增體系。

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本文第一作者簡介：

董 晶(1981-)，男，漢族，碩士，主管技師

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Human Platelet Lysate Enhances Human Amnion-derived Mesenchymal Stem Cells (AMMSCs) Osteogenic Differentiation

DONG Jing，NIE Li-ping，ZHOU Yu

Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen 518036,China

Objective: To investigate the effect of human platelet lysate (HPL) on amnion-derived mesenchymal stem cells (AMMSCs) osteogenic differentiation.Method: AMMSCs were amplified by LG-DMEM medium supplemented with 7% HPL(HPL group) or 10% fetal bovine serum (FBS,FBS group). The surface molecular markers potential SSEA-3 and SSEA-4 were compared. When AMMSCs were used for osteogenic differentiation, ALP activity and calcium deposition were comparatively observed. Total RNA was isolated and the gene expression of RUNX-2 and ALP were investigated by RT-PCR.Results: HPL-containing medium significantly accelerated MSCs proliferation as compared with FBS containing medium. Expressions of embryonic stem cell markers SSEA-3 and SSEA-4 on AMMSCs were promoted down-regulation by HPL-containing medium than that of FBS-containing medium. HPL-containing medium significantly improved ALP activity and calcium deposition, which also enhanced the mRNA level of RUNX-2 and ALP (P<0.05).Conclusion: HPL-containing medium promotes osteogenic differentiation of AMMSCs.

Human platelet lysate; Mesenchymal stem cells; Amnion; Osteogenic differentiation

北京大學深圳醫院，深圳 518036

本文2015-01-10收到，2015-03-18修回

Q343.6

A

1005-1740(2015)02-0022-05