三峽庫區5個鰱群體遺傳變異的微衛星分析

龐美霞俞小牧童金茍

(1. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072； 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

三峽庫區5個鰱群體遺傳變異的微衛星分析

龐美霞1,2俞小牧1童金茍1

(1. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072； 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

研究利用 10個高度多態的微衛星標記對三峽水庫秭歸、巫山、云陽、忠縣、木洞等 5個庫區鰱(Hypophthalmichthys molitrix)的野生群體進行了遺傳多樣性分析。檢測到161個等位基因, 群體共有等位基因84個, 每個微衛星位點的等位基因數7—29不等。平均觀測雜合度Ho為0.784—0.846, 平均期望雜合度He為0.828—0.847, 平均多態信息含量PIC為0.797—0.817。Fst值為–0.001—0.009, 表明5個鰱群體間沒有遺傳分化。Hardy-Weinberg平衡檢驗表明巫山、云陽、木洞群體在一些位點上偏離遺傳平衡。Bottleneck分析顯示長江三峽庫區江段的鰱群體可能在歷史上經歷了遺傳瓶頸。5個群體間的遺傳相似系數為0.891—0.950, 遺傳距離為 0.050—0.115, 根據 Nei’s遺傳距離所繪制的聚類圖, 表明鰱群體間的遺傳距離與其地理距離基本一致。貝葉斯分析結果也證實三峽庫區 5個鰱群體可視為一個類群。盡管沒有檢測到遺傳分化, 數據清晰地表明三峽庫區的鰱群體仍有很高的遺傳多樣性, 研究結果為三峽地區和長江上游的鰱種質資源保護和種群評估提供了參考。

鰱； 微衛星； 野生群體； 遺傳多樣性； 三峽水庫

鰱(Hypophthalmichthys molitrix)是我國“四大家魚”之一, 廣泛分布于我國長江、黑龍江、珠江等各大水系, 是我國重要的經濟魚類。長江流域是我國鰱天然資源的主要產地, 其養殖性能明顯優于珠江、黑龍江等其他水系[1]。然而由于長期的過度捕撈、水體污染、水利建設等一系列人為因素導致近年來長江水系自然環境劇烈變化[2], 從而引起包括鰱在內的“四大家魚”資源量的嚴重衰退[3]。群體遺傳分析是合理評估魚類種群遺傳多樣性和種群分化的有效手段。過去已有一些針對長江流域鰱野生群體遺傳多樣性分析的報道[4—8], 但主要集中在長江中下游地區, 有關長江中上游地區的相關報道少見[6]。長江三峽水庫已經建成, 針對這一河流型水庫中鰱野生種群的遺傳結構分析方面的資料還非常缺乏,這種狀況不利于魚類資源的評估和合理利用。

微衛星標記是一種以1—6 bp的核苷酸序列為核心序列的簡單重復序列[9], 由于其具有共顯性遺傳、數量多且分布廣泛均勻、多態信息含量高及便于檢測等諸多優點, 已被廣泛應用于群體遺傳分析[10,11]。本研究采用本實驗室開發的4—5核苷酸重復的10個多態性鰱微衛星標記對來自三峽水庫從庫首到庫尾的5個庫區(秭歸、巫山、云陽、忠縣、木洞)的鰱樣本進行分析, 旨在掌握三峽庫區以及長江上游鰱野生群體的遺傳多樣性和遺傳結構現狀, 為長江流域“四大家魚”種質遺傳資源的保護和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及DNA提取

本實驗所分析的 5個野生鰱群體樣本采集于2012—2013年, 采樣點位于湖北省秭歸(ZG)、重慶市巫山(WS)、云陽(YY)、忠縣(ZX)和木洞鎮(MD),樣本總數227尾(表1、圖1)。剪取每尾魚的少量鰭條用無水酒精保存, 基因組 DNA采用經典的酚-氯仿法[12]提取。

表1 三峽庫區5個鰱群體樣本的基本信息Tab. 1 The basic information of five silver carp populations in the Three Gorges Reservoir

1.2 標記選取及PCR擴增

在本研究中使用的標記均來自于本實驗室開發的鰱微衛星標記。為了能夠清晰地分型便于數據統計, 本文所選取的 10個鰱微衛星標記[13]均是 4—5堿基重復的高度多態性位點(表2)。根據Li-Cor 4300 DNA 分析系統的檢測要求, 在合成每一對微衛星引物時, 將一段19堿基( 5′-CACGACGTTGTAAAA CGAC-3′)的接頭序列添加到每一個微衛星位點的正向引物序列 5′端[14]。在PCR進行擴增時, 帶有接頭序列的微衛星上游引物既可與目的片段結合, 又可與 5′端帶有熒光接頭的 IR-M13F引物[M13 Forward(-29) IRDye 700 Primer 或M13 Forward (-29) IRDye 800 Primer] (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) 結合, 從而把IR-M13F 帶入到擴增反應中, 使得擴增的目的片段末端帶有熒光標記從而通過 4300 DNA 分析儀檢測并成像[15]。 本文所用的微衛星引物和熒光標記引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反應總體積為12.5 μL, 反應混合物包含以下組分: 30—50 ng模板DNA, 0.4 U Taq DNA聚合酶, 1.25 μL 10×PCR buffer, 0.4 μL dNTP (2.5 mmol/L), 0.4 μL正反向混合引物(各 2.5 μmol/L), 0.3 μL IR-M13F引物, 10 μL滅菌去離子水。PCR擴增條件如下: 94℃預變性5min； 擴增35個循環, 每個循環94°C變性35s, 48—60℃退火35s(退火溫度見表2), 72℃延伸40s； 72℃終延伸10min。

1.3 微衛星分型及數據統計

在 PCR擴增結束后, 在含有擴增產物的薄壁管中加入 7 μL變性劑( 98%去離子甲酰胺, pH 8.0, 10 mmol/L EDTA, 0.25%溴酚藍), 95℃變性10min后立即將置于冰水中冷卻。變性產物在 Li-Cor 4300 DNA分析儀中進行電泳檢測并自動成像。MS-TOOLS軟件用于計算觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、等位基因數(Na)等多樣性參數, 以及計算多態信息含量(PIC)。PopGene 32軟件計算各個群體間的Nei’s遺傳距離[16]和相似系數。并根據Nei’s遺傳距離用 MEGA 4軟件[17]對 5個鰱群體進行聚類分析。Arlequin 3.1軟件[18]計算各群體間的分化系數 Fst, 同時用于進行各群體的哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)檢驗、連鎖不平衡(Linkage disequilibrium)檢驗。進行多重比較時, 概率的顯著性水平需要進行 Bonferroni校正[19]。利用分子變異分析(AMOVA)方法[20]計算群體遺傳結構。根據各位點等位基因頻率, 使用BOTTLENECK3.4軟件[21]進行瓶頸效應分析。基于無限等位基因模型(Infinite allele model, IAM), 采用符號檢驗(Sign test)分析雜合度過剩情況, 依此推測群體數量動態變化。利用Structure 2.2[22]軟件中的貝葉斯方法混合模型來構建群體遺傳結構圖。

圖1 三峽水庫鰱群體采樣點分布示意圖Fig. 1 Distribution of sampling sites for silver carps in the Three Gorges Reservoir

表2 本研究所用鰱微衛星標記的基本信息Tab. 2 The microsatellite markers of silver carps used in this study

2 結果

2.1 鰱各群體的遺傳多樣性特征及群體動態分析

5個鰱群體各位點的等位基因數(Na)、期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)以及多態信息含量(PIC)統計結果見表3。在10個微衛星位點上共檢測到161個等位基因, 其中ZG、WS、YY、ZX、MD群體分別測出127、107、122、135和123個等位基因, 5個鰱群體共有等位基因84個, 并且ZG、WS、YY、ZX、MD群體分別有4、3、5、5和2個特殊等位基因。每個微衛星位點的等位基因數7—29不等。ZX群體的平均Na最高(13.5), 巫山群體最低(10.7)。平均 Ho、He和 PIC分別為 0.784—0.846、0.828—0.847和0.797—0.817, 其中WS群體Ho最低, ZX群體Ho最高； YY群體He和PIC在所有群體中均最低,而ZG群體He和PIC在所有群體中均最高。

對各個鰱群體進行哈迪-溫伯格平衡檢驗并用Bonferroni校正后發現, WS群體在 Hysd792-1、Hysd490-2、Hysd2095-1、Hysd209-2、Hysd497-1 位點, YY群體在 Hysd2095-1位點, MD群體在Hysd490-2、Hysd1063-2 位點, 在 0.05置信水平上偏離哈迪-溫伯格平衡。而連鎖不平衡分析結果顯示,所有10個微衛星標記在5個鰱群體均不存在連鎖不平衡。遺傳瓶頸效應分析結果(表3)顯示, 在IAM模型下, 除 ZX群體外其他群體均表現出雜合過度(P＜0.05), 表明這些群體近期可能經歷了瓶頸效應。

2.2 群體間的遺傳分化

5個鰱群體的遺傳分化分析結果表明, 群體間的Fst值(表4)為–0.001—0.009, 群體兩兩間Fst差異均不顯著(P＞0.05), 表明他們沒有遺傳分化。AMOVA分析結果顯示群體間的遺傳變異僅占0.47% , 而群體內的遺傳變異占99.53% 。對群體內的各個體進行混合模型分析結果顯示, 當K值(理論群)取2時, 5個鰱群體遺傳結構高度一致； 當K值取3—5時, WS群體少部分個體遺傳結構相對獨立, 5個鰱群體遺傳結構基本一致。鰱各個群體間的遺傳距離和相似系數如表 5所示。Nei氏遺傳距離和相似系數分別為 0.050—0.115、0.891—0.950, 以 ZX群體和MD群體之間的遺傳距離最小, 而MD群體與WS群體之間的遺傳距離最大。

依據計算出來的Nei氏遺傳距離(表5), 5個野生鰱群體的聚類分析結果(圖2)顯示, 鄰接樹中共有兩大分枝, 其中ZG和WS聚為一枝, 其余3個群體聚為另一大分枝。這個聚類結果基本與群體間的地理距離關系一致。

表4 三峽庫區5個鰱群體兩兩間Fst值Tab. 4 Pairwise Fstvalues of five silver carp populations in the Three Gorges Reservoir

表5 五個鰱群體兩兩間Nei遺傳一致性(對角線上方)和遺傳距離(對角線下方)Tab. 5 Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) among five silver carp populations

圖2 依據Nei氏遺傳距離構建的三峽庫區鰱5個鰱群體間的鄰接樹Fig. 2 Neighbour-Joining tree of five silver carp populations in the Three Gorges Reservoir of the Yangtze River based on Nei’s genetic distance

3 討論

3.1 微衛星標記的適用性

微衛星標記具有共顯性遺傳、數量多且在基因組中分布廣泛、多態信息含量高及便于檢測等諸多特點, 是物種種群遺傳分析的最常用分子遺傳標記。微衛星標記的多態性來源于微衛星核心重復序列重復次數的變化[23], 與其他諸如RAPD、AFLP、SNP等標記相比, 微衛星標記具有更高的分辨率。本研究采用的10個鰱微衛星標記, 均是4—5堿基重復序列。有研究表明, 相比于二核苷酸重復的微衛星標記, 多核苷酸重復的微衛星標記的擴增穩定性更高, 能忠實地反映DNA序列遺傳本質[24,25]。在長江三峽庫區 5個野生鰱群體中, 每個微衛星位點的等位基因數從7—29不等(表3), 表明這10個微衛星均為較高多態性的座位。平均多態信息含量(PIC)是衡量等位基因片段多態性的理想指標, 當PIC＞0.5時該位點表現為高度多態, 當 0.25＜PIC＜0.5時該位點表現為中度多態, 當PIC＜0.25 時該位點表現為多態性低下[26]。在本研究中使用的10個微衛星標記中, 除了 Hysd2095-1為中度多態性以外,其余標記的PIC值均大于0.7為高度多態(表3), 這說明本文所選用的微衛星位點是鰱野生群體遺傳多樣性研究的理想分子遺傳標記。

3.2 鰱群體遺傳多樣性及群體動態分析

基因雜合度表示群體在某座位雜合子的比例。觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)是反映群體遺傳變異的兩個重要指標。雜合度越大變異越大, 對環境適應能力越強[7]。本研究發現 5個鰱野生群體的平均等位基因為 10.7—13.5, 平均有效等位基因數Ne為 6.6—7.5, 平均觀測雜合度Ho為0.784—0.846,平均期望雜合度He為 0.828—0.847, 平均多態信息含量PIC為0.797—0.817(表3), 這說明三峽庫區鰱野生群體遺傳多樣性仍在很高水平, 對長江“四大家魚”種質資源保護和恢復有積極意義。關于長江流域鰱群體遺傳多樣性分析, 迄今已有一些報道。朱曉東等[5]利用30個微衛星標記對長江中下游5個鰱群體進行遺傳多樣性分析, 發現這 5個鰱群體的平均有效等位基因數 Ne為 2.444—2.633, 平均觀察雜合度 Ho為 0.323—0.351,平均期望雜合度 He為0.442—0.470,平均多態信息含量 PIC 為 0.406—0.428。王長忠等[6]對長江中上游萬州和監利鰱群體的遺傳多樣性分析顯示, 兩個鰱群體的平均有效等位基因數Ne分別為4.107和3.395；平均觀測雜合度Ho為0.834和0.775,平均期望雜合度He為0.713和0.623； 兩群體平均多態信息含量 PIC為 0.617。由于本研究采用的微衛星標記絕大部分為高度多態性標記, 而且本文采用更加靈敏的熒光標記基因分型手段, 因此Ne比過去的報道要高的多。本研究中Ho、He、PIC等遺傳多樣性參數也遠高于朱曉東等關于長江中下游 5個鰱群體的報道, 而與王長忠等[6]對于長江中上游2個鰱群體的報道較為接近。 這可能在一定程度上表明, 長江中上游相較于長江中下游鰱群體的遺傳多樣性更為豐富。

本文在所檢測的微衛星位點中, WS群體在5個位點、YY群體在1個位點、MD群體在2個位點偏離哈迪-溫伯格平衡。可見WS群體內有較多位點的基因型頻率發生了較大改變, 而這種改變可能與多種因素有關, 例如突變、選擇、遷移和雜交等。當一個群體的基因位點出現雜合度過剩及不足的概率大致均等時, 表明這個群體處于突變-漂移平衡的狀態[27]。而當群體經歷瓶頸效應則會表現出雜合度過剩的現象, 因此雜合度過剩可以衡量群體數量下降的瞬間效應[28]。本研究采用 IAM 模型符號檢驗發現, ZG、WS、YY、MD 4個群體顯示出顯著雜合子過剩(表 3), 說明以上 4 個群體可能在近期經歷了不同程度的瓶頸效應, 群體數量發生一定程度的下降。在長江三峽水庫建成運行的條件下, 庫區過度人工捕撈等因素尤其應該引起重視, 以免對鰱等“四大家魚”的遺傳資源造成不可逆的破壞。

3.3 鰱群體遺傳分化

基因分化系數是衡量群體間等位基因的遺傳分化程度的重要參數。當 Fst為 0—0.05 時, 群體間遺傳分化很弱； 0.05—0.15 時, 遺傳分化中等； 0.15—0.25時, 遺傳分化較大；大于0.25時, 表示群體間分化極大[29]。在 本研究中各群體間的 Fst值均小于0.05(表4), 表明三峽庫區5個鰱野生群體間幾乎沒有分化。AMOVA分析結果也支持這一結果: 群體間的遺傳變異只占0.47% , 而群體內的遺傳變異高達 99.53% , 表明三峽庫區鰱的遺傳變異基本來自于群體內部。利用 structure軟件中混合模型, 根據設定的分群數(K)進行群體遺傳結構研究, K=2—5時均顯示 5個鰱群體間遺傳分化不明顯, 基本可劃分為一個類群。而ZG、WS、YY、ZX、MD 5個群體各有4、3、5、5和2個特殊等位基因, 這些特殊基因可能為 5個群體間將來出現遺傳分化提供方向。過去的一些研究報道認為長江流域中各鰱群體或江段之間存在一定程度的遺傳分化。如王淞等[7]對4 個鰱群體進行了mtDNA D-loop的PCR-RFLP分析, 結果顯示長江干流的監利和瑞昌兩個群體與長沙及寧河群體間有一定的分化； 朱曉東等[5]對長江中下游5個鰱群體進行了微衛星分析發現5個鰱群體間存在中等程度的分化； 而王長忠等[6]對長江中上游萬州和監利兩個鰱群體進行了微衛星分析認為萬州和監利鰱群體間存在顯著遺傳分化, 應隸屬于不同的種群。本研究認為三峽庫區的5個鰱群體間沒有遺傳分化, 可以看成一個天然群體。這一結果也與郭穩杰[13]對長江中上游9個鰱群體的微衛星分析結果類似。郭穩杰[13]認為除湖口外, 其他群體間只呈現出較弱的群體分化。本文所研究的三峽庫區的 5個采樣點, 盡管有少數采樣點在長江支流,但整體來說這5個群體之間的地理距離都不是太大,目前也沒有明顯的地理隔離, 故我們認為這些水域的鰱群體之間進行了較頻繁的基因交流。

根據Nei氏遺傳距離(表5)所繪制的5個野生鰱群體的鄰接樹(圖2)顯示, YY與MD的遺傳距離最小, 而與 WS最大, 表明群體間的遺傳距離與地理距離之間有一定的關聯性。但也并非完全地理位置越遠的群體間遺傳分化程度越大, 例如 YY在地理位置上與ZX和WS更近, 結果顯示YY與MD的聚類關系反而更近, 這可能是由于 YY部分位點偏離哈迪溫伯格平衡, 導致部分基因型缺失, 從而在一定程度上影響了其遺傳多樣性； 而YY與WS的聚類關系反而最遠, 可能是由于 WS獨特的地理環境導致WS群體與其他群體間的基因交流受到一定影響； 也有可能是由于 WS群體受到較大的捕撈壓力導致基因型頻率受到影響。

遺傳多樣性是種內個體之間或群體內不同個體的遺傳變異總和, 是生物適應環境的基礎, 同時種內的遺傳變異程度又決定其進化的潛勢[30]。對一個物種來說, 遺傳多樣性越高, 則其對生存環境變化所產生的適應能力越強, 進化的潛力也越大。由于過去對長江上游尤其是三峽庫區鰱野生群體的遺傳多樣性和遺傳結構的現狀了解不多, 人類對該地區鰱、鳙等經濟魚類的種群動態和種質資源評價方面長期缺乏群體遺傳學分析數據。本研究的結果證實長江三峽庫區范圍內的鰱基本可看作一個天然群體,也在一定程度上給出了該地區鰱群體仍有較高的遺傳多樣性的事實。本研究分析結果也提示三峽地區可能多個鰱群體曾發生過遺傳瓶頸效事件, 這也應引起魚類保護生物學工作者的注意。本文對于長江上游以及整個長江流域的鰱野生資源保護或增殖放流效果評估等研究有積極作用。

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THE MICROSATELLITE ANALYSIS OF GENETIC DIVERSITY OF FIVE SILVER CARP POPULATIONS IN THE THREE GORGES RESERVOIR OF THE YANGTZE RIVER

PANG Mei-Xia1,2, YU Xiao-Mu1and TONG Jin-Gou1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China； 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

In this study we employed ten microsatellite markers to analyze the genetic diversity of five silver carp populations including Zigui, Wushan, Yunyang, Zhongxian and Mudong in the Three Gorges Reservoir of the Yangtze River. A total of 161 different alleles were detected, and 84 of them were common in all 5 populations. The number of alleles per locus ranged from 7 to 29. In the five populations, the average values of observed and expected heterozygosity ranged from 0.784 to 0.846 and 0.828 to 0.847 respectively, and the mean PIC was 0.797 to 0.817. The Fstvalues were between –0.001 and 0.009, which indicated that the genetic differentiation was not significant. Chi-square test was used to analyze the genotypes based on the Hardy-Weinberg equilibrium, and the P value indicated that some loci in three populations deviated from the HWE. The bottleneck analysis revealed that the silver carp populations from the Three Gorges Reservoir of the Yangtze River might have undergone a recent genetic bottleneck. The genetic similarity coefficient of the five populations was between 0.891 and 0.950, and the genetic distance of the populations was between 0.050 and 0.115. We also constructed the phylogenetic tree of the five silver carp populations based on Nei’s standard genetic distance, and the results showed that genetic distances between the populations were consistent with their geographical distances. The Bayesian analysis also suggested that the silver carp samples from the 5 locations of the Three Gorges Reservoir could be characterized as a single population. Although we did not observe the genetic differentiation, silver carp populations in the Three Gorges Reservoir displayed high genetic diversity. Our study provided valuable information on the genetic resources of silver carps in the Three Gorges Reservoir and in the upstream of the Yangtze River, which should help develop appropriate policies on the conservation and utilization of silver carps.

Silver carp (Hypophthalmichys molitrix)； Microsatellite； Wild population； Genetic diversity； The Three Gorges Reservoir

Q346+.5

A

1000-3207(2015)05-0869-08

10.7541/2015.115

2015-02-12；

2015-03-26

中國長江三峽集團公司科研項目(CT12-08-01)； 淡水生態與生物技術國家重點實驗室自主課題(2011FBZ20)資助

龐美霞(1989—), 女, 湖南長沙人； 博士研究生； 主要從事魚類遺傳學研究。E-mail: pang1mei2xia3@163.com

童金茍, E-mail: jgtong@ihb.ac.cn