抑肽酶對腦出血大鼠凝血酶敏感蛋白的影響

何效平，江承平，2，王柏強，2，羅 飛，2，劉 福，2，吳碧華，王曉明

（1．川北醫學院附屬醫院藥劑科，四川 南充 637000； 2．川北醫學院藥學院，四川 南充 637000；3．川北醫學院神經病學研究所，四川 南充 637000）

抑肽酶對腦出血大鼠凝血酶敏感蛋白的影響

何效平1，江承平1，2，王柏強1，2，羅 飛1，2，劉 福1，2，吳碧華3，王曉明3

（1．川北醫學院附屬醫院藥劑科，四川 南充 637000； 2．川北醫學院藥學院，四川 南充 637000；3．川北醫學院神經病學研究所，四川 南充 637000）

目的觀察抑肽酶對腦出血大鼠腦內損傷區凝血酶敏感蛋白(TSP)-1和TSP-2及其受體CD36 mRNA的影響，探討抑肽酶治療腦出血的機制。方法將SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、抑肽酶組，采用膠原酶誘導建立大鼠腦出血模型，運用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法觀察腦出血后TSP-1及TSP-2和CD36 mRNA表達變化。結果腦出血第4天，TSP-1表達達高峰；TSP-2第14天表達達高峰；腦出血第4天，第21天CD36呈雙峰表達。抑肽酶組TSP-1 mRNA表達第1～4天明顯高于模型組(P＜0．01)；TSP-2 mRNA第14天達高峰且第1～21天均明顯高于模型組(P＜0．05)；CD36 mRNA第1～4天表達明顯低于模型組(P＜0．05)，第14～21天明顯高于模型組(P＜0．01)。結論抑肽酶可能通過調整腦出血大鼠腦內TSP-1及TSP-2和CD36 mRNA的表達，降低其對血管新生的抑制作用，加快血腫吸收，促進腦組織修復。

抑肽酶；腦出血；凝血酶敏感蛋白；CD36；大鼠

腦出血占全部腦血管病的10%～20%，病死率高達50%，其中40%的存活者遺留嚴重殘疾，是威脅中老年人健康的主要疾病之一[1-2]。目前，對腦出血的研究主要集中在腦出血后腦水腫、炎性反應、氧自由基等方面[3]，很少涉及腦出血后腦組織損傷區的微血管重建。腦是機體耗氧量最高的器官，其氧的供給有賴于良好的血供，因此研究腦出血后損傷區的微血管重建十分有必要。凝血酶敏感蛋白（TSP)是影響神經系統發育、參與腦微血管重建的重要因子之一[4]。抑肽酶是從動物臟器中提取的堿性單鏈多肽，能通過多種機制提高腦出血患者的神經功能[5-6]。本研究中，通過觀察抑肽酶對試驗性腦出血大鼠腦內TSP-1及TSP-2表達的影響，從腦出血后病灶局部血管新生的角度探討該方面的作用機制，為其臨床治療腦出血的機制提供新的理論依據。

1 材料與方法

1．1 動物、試藥與儀器

健康雄性SD大鼠90只，體重250～300 g，購自川北醫學院實驗動物中心，動物許可證號SCXK(川)2008-18。抑肽酶(批號為081023，100萬 kU／mL，麗珠集團麗寶生物化學制藥有限公司)；Ⅶ型膠原酶（Sigma公司）；Trizol（購自invitrogen公司）；RTPCR試劑盒寶生物工程＜大連＞有限公司，其余試劑均為國產分析純。TGRADIENT型PCR儀(德國Biometra公司)；Stoel Ting TL-2型鼠腦定位儀(購自美國)；微量進樣器(購自上海高鴿工貿有限公司)。

1．2 方法

動物模型制備：參考文獻[7]，復制腦出血大鼠模型，用10%水合氯醛腹腔注射(400 mg／kg)麻醉后，將大鼠俯臥固定于鼠腦定位儀上，局部消毒，切開皮膚，顱骨窗型切開，蒼白球定位，取前囟后1．4 mm，右旁開3．2 mm處垂直進針5．6 mm，以微量進樣器緩慢注入含0．5 UⅦ型膠原酶的生理鹽水2．5 μL，2 min注畢，留針5 min，拔針縫合皮膚，局部絡合碘消毒。假手術組以同樣方法注入滅菌生理鹽水2．5 μL。

動物模型分組與給藥：所有大鼠隨機分為假手術組、模型組、抑肽酶組，各30只。抑肽酶組按每100 g體重5萬kU劑量（相當于臨床給藥劑量的10倍）用微量注射器經尾靜脈注射；假手術組與模型組用同樣方法注射等體積生理鹽水。

標本采集：分別于術后1，4，7，14，21，28 d隨機抽取5只大鼠，用10%水合氯醛麻醉后處死，分離右側腦組織，取以蒼白球(腫)為中心的基底節部分腦髓質約100 mg，置凍存管，放入液氮中，-80℃保存備用。

RT-PCR方法檢測TSP-1及TSP-2和CD36 mRNA表達：總 RNA提取和 RT-PCR按 Trizol和 TaKaRa試劑盒操作，PCR引物序列，TSP-1為5′-AACGTGGATCAGAGGGACAC-3′，5′-GTCATCGTCATGGTCACAGG-3′；TSP-2為 5′-CAGCGGCACTTTCTATGTCA-3′，5′-CCGTCCACCAGCATAAGTTT-3′；CD36為5′-CTCTGACATTTGCAGGTCCA-3′，5′-CACAGGCTTTCCTTCTTTGC-3′；β-actin1為 5′-ACCCACACTGTGCCCATCTATGA-3′，5′-CATCGGAACCGCTCATTGCCGATAG-3′；β-actin2為5′-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，5′-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3′。引物設計參照文獻，并經GenBank驗證。PCR循環為，94℃預變性1 min，(94℃30 s，55℃1 min，72℃1 min)×30次循環，72℃延伸7 min。內參與目的基因在同一反應體系中擴增。PCR產物用1．5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，在 Eagle EyeⅡ型圖像處理系統上測量 TSP-1及 TSP-2和 CD36電泳帶的光密度，用 β-actin作為參照，求出 TSP-1及 TSP-2和 CD36的相對值。

1．3 統計學處理

采用SPSS 11．0統計軟件分析。組間差異采用單因素方差分析，組間均數兩兩比較采用LSD法，結果以表示。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

假手術組TSP-1及TSP-2和CD36 mRNA未見明顯陽性信號。模型組TSP-1在腦出血早期就開始表達，第4天達高峰，之后緩慢下降；抑肽酶組表達第1～4天明顯升高，其光密度值明顯高于模型組(P＜0．01)，見圖1A、圖1B及表1。模型組TSP-2的光密度值在腦出血術后第1天開始上升，第14天達高峰，第21～28天明顯下降(P＜0．01)；抑肽酶組表達趨勢與模型組相同，第1～35天各時間點光密度值均明顯高于模型組(P＜0．01)，見圖1C、圖1D及表1。模型組CD36第1天表達明顯，第4天表達最強（P＜0．01），之后緩慢下降，第21天又增強（P＜0．01），第28天減弱；抑肽酶組第1天和第4天表達明顯弱于模型組（P＜0．05），第14～28天表達高于模型組(P＜0．01)，見圖1E、圖1F及表2。

圖1 腦出血大鼠凝血酶敏感蛋白及受體mRNA表達的瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 抑肽酶對腦出血后TSP-1及TSP-2表達的影響(，n=5)

表1 抑肽酶對腦出血后TSP-1及TSP-2表達的影響(，n=5)

注：與假手術組相比，＃P＜0．05；與模型組相比， P＜0．05。下表同。

組別 TSP-1 TSP-2假手術組模型組抑肽酶組1 d 0．26±0．18 0．54±0．13＃0．83±0．10 4 d 0．26±0．18 0．85±0．05＃1．49±0．48 7 d 0．26±0．18 0．81±0．06＃0．96±0．36 14 d 0．26±0．18 0．66±0．13＃0．65±0．06 21 d 0．26±0．18 0．51±0．03＃0．59±0．02 28 d 0．26±0．18 0．48±0．11＃0．55±0．05 1 d 0．16±0．06 0．49±0．24＃0．76±0．04 4 d 0．16±0．06 0．55±0．07＃0．84±0．05 7 d 0．16±0．06 0．77±0．03＃0．95±0．16 14 d 0．16±0．06 1．00±0．14＃1．41±0．11 21 d 0．16±0．06 0．92±0．01＃1．10±0．06 28 d 0．16±0．06 0．86±0．11＃1．02±0．10

表2 抑肽酶對腦出血后CD36表達的影響(，n=5)

表2 抑肽酶對腦出血后CD36表達的影響(，n=5)

組別假手術組模型組抑肽酶組1 d 1．22±0．12 1．55±0．20＃1．18±0．27 4 d 1．22±0．12 2．35±0．31＃1．99±0．70 7 d 1．22±0．12 1．81±0．30＃1．87±0．20 14 d 1．22±0．12 1．56±0．23＃1．97±0．22 21 d 1．22±0．12 2．13±0．21＃2．56±0．19 28 d 1．22±0．12 1．85±0．27＃2．24±0．18

3 討論

凝血酶敏感蛋白(TSPs)因其與血管新生、基質重塑的關系密切，其結構功能及作用機制已成為國內外研究的熱點。TSP-1和TSP-2同屬于TSPs的一個亞家族，為非結構基質蛋白，通過調節細胞-細胞、細胞-基質的相互作用，影響細胞功能，維持基質平衡[8-9]。兩者結構、功能相似，但其啟動子序列不同，在體內不同時間、空間，不同細胞所表達的劑量、形式、構象亦可不同，因此其生理學作用也大有不同，在與各種分子的相互作用及所處環境中確立其功能[8-9]。TSP-1不但對血管平滑肌細胞的炎性反應因子起負性調節作用[10]，且能調節心肌梗死后的血管新生，減少未梗死區的損傷[11]。TSP-2是一種多功能糖蛋白，具有與凝血酶、纖維蛋白原、纖維連接蛋白、肝素等多種物質結合的位點，其在內皮細胞、纖維母細胞等多種細胞內合成并被分泌到細胞間質中，發揮調節細胞表面功能、影響細胞的黏附和移動、維持基質平衡等作用[8-9]。CD36是一種糖基化和棕櫚酰化修飾的單鏈跨膜蛋白，屬B類清道夫受體家族。廣泛存在于微血管內皮細胞、單核-巨噬細胞、血小板等多種細胞。CD36與Ⅰ型膠原、長鏈脂肪酸、凋亡細胞等不同配體結合后表現出多種復雜的生物學功能。TSP-1與 TSP-2結構中，Ⅰ型重復序列包含的高度保守CSVTCG序列能介導與 CD36的黏附，在抗血管新生、血小板聚集、單核細胞黏附等過程中起重要作用[8]。該序列與血管內皮細胞上的 CD36結合，可激活 Caspase-3，誘導內皮細胞凋亡[12]。CD36作為TSP-1與TSP-2共同的受體，在血小板、單核細胞和微血管內皮細胞表面均有表達[13]。

本研究結果顯示，TSP-1在腦出血后第 4天表達達高峰，TSP-2在第14天表達達高峰，CD36在腦出血早期和晚期表達都較高。在腦出血早期，由于腦水腫引起的占位效應以及內皮素-1釋放引起血管痙攣收縮，導致組織缺血缺氧，而使TSP-1表達上調[14-15]。TSP-1通過與其受體CD36結合，促進凋亡的白細胞與巨噬細胞黏附而被吞噬，抑制炎性反應，減少新生血管的損傷[16]。在腦出血中后期，TSP-1表達逐漸下降，而TSP-2的表達漸達高峰，兩者相結合共同調節細胞外基質的降解，對新生血管進行修剪和重塑，從而調節管腔結構形成和血管的成熟[8]。CD36在晚期表達增高，主要是調整局部的基質成分的重新分布和脂代謝等，Simantov等[13]的研究結果顯示，TSP-2的抗血管新生作用主要是由于CD36與其TSR片段相結合，故第21天2種的表達均處于較高水平。在應用抑肽酶治療后，TSP-1 mRNA和TSP-2 mRNA的表達高峰均明顯上調。第4天時腦出血后的炎性反應達高峰，抑肽酶通過上調TSP-l的表達而抑制白細胞的浸潤，對抗炎性反應，從而明顯減少新生血管的損傷，保障損傷區的血供。在中后期，抑肽酶對 TSP-1的表達無明顯增強，而對TSP-2的表達顯示出促進作用，提示抑肽酶能抑制細胞外基質降解，防止新生管腔過度增生。通過對細胞外基質修飾作用的調節，進而調節腦出血后新生血管的成形、分布及功能。抑肽酶通過下調CD36的表達而抑制Caspase-3激活，減輕腦出血后細胞凋亡[17]。

綜上所述，抑肽酶能調節TSP-1，TSP-2和CD36的表達而促進新生血管成形、成熟，有益于腦出血后的組織修復，其具體機制有待進一步研究。

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Influence of Aprotinin on the Thrombospondin in Rats with Intracerebral Hemorrhage

He Xiaoping1,Jiang Chengping1,2,Wang Baiqiang1,2,Luo Fei1,2,Liu Fu1,2,Wu Bihua3,Wang Xiaoming3
(1．Department of Pharmacy,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong,Sichuan,China 637000; 2．School of Pharmacology,North Sichuan Medical College,Nanchong,Sichuan,China 637000; 3．Neurology Research Institute,North Sichuan Medical College,Nanchong,Sichuan,China 637000)

Objective To observe the influence of aprotinin on the expressions of thrombospondin (TSP)-1,TSP-2 and their receptor CD36 in rats′brains of intracerebral hemorrhage(ICH)and to explore its mechanisms．M ethods SD rats were randomly divided into 3 groups:sham operated group,ICH model group,and aprotinin therapy group．The rat model of cerebral hemorrhage was induced by collagenase;the distribution of TSP-1,TSP-2 and CD36 were assayed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)．Results TSP-1 arrived at the peak on the 4th day after ICH(P＜0．01);TSP-2 arrived at the peak on the 14th day while CD36 on the 4th day and 21st day．In Aprotinin therapy group,the expression of TSP-1mRNA was notably higher than that of ICH model group from the 1st day to 4th day(P＜0．01);TSP-2 mRNA arrived at the peak on the 14th day and was higher than that of ICH model group from the 1st day to 21st day of ICH (P＜0．05)．CD36 was lower from the 1st day to 4th day of ICH (P＜0．01)but higher from the 14th day to 21sth day of ICH(P＜0．01)．Conclusion Aprotinin could regulate the expressions of TSP-1,TSP-2 and CD3636mRNA in rats after ICH to lower the depressant effects on angiogenesis,accelerate the absorption of hematomas and promote cerebral tissue repair．

aprotinin;intracerebral hemorrhage;thrombospondin;CD36;rats

R965；R973+.2

A

1006-4931(2015)21-0022-03

何效平（1972-），女，大學本科，主管藥師，研究方向為藥物基礎與臨床，（電子信箱）xphe1972＠163．com；江承平，教授，研究方向為藥物基礎與臨床，本文通訊作者，（電子信箱）jiangcp1967＠163．com。

2015-05-13)

四川省南充市重點科技資助項目，項目編號：N2008-SF010。