P53介導(dǎo)的活性氧通路對(duì)硒酸酯多糖誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用

來小丹，冉啟文，歐陽凈，石 英

（中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400000）

P53介導(dǎo)的活性氧通路對(duì)硒酸酯多糖誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用

來小丹，冉啟文，歐陽凈，石 英

（中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400000）

目的探討P53介導(dǎo)的活性氧(ROS)通路在硒酸酯多糖誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡中的作用。方法采用不同質(zhì)量濃度硒酸酯多糖處理OS-732細(xì)胞，分析各組細(xì)胞的增殖、凋亡情況、ROS水平及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果硒酸酯多糖處理后，OS-732細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度抑制，呈現(xiàn)出時(shí)間和濃度依賴性，60 g／L質(zhì)量濃度處理48 h時(shí)OS-732細(xì)胞抑制率最高；20，40，60 g／mL質(zhì)量濃度處理24 h后，ROS水平顯著增加（P＜0．05），OS-732細(xì)胞凋亡率顯著升高，其中早期凋亡細(xì)胞及晚期凋亡細(xì)胞百分比與0 g／mL相比均有顯著性差異（P＜0．05）；P53，Caspase-9及Bax表達(dá)隨著藥物質(zhì)量濃度的增加而升高，而Bcl-2的表達(dá)顯著降低（P＜0．05）。結(jié)論硒酸酯多糖處理骨肉瘤細(xì)胞能顯著抑制OS-732細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)凋亡，細(xì)胞內(nèi)高水平的ROS狀態(tài)可能在此過程中有重要作用。

硒酸酯多糖；骨肉瘤；細(xì)胞凋亡

骨肉瘤是起源于成骨樣腫瘤細(xì)胞或分泌骨質(zhì)的腫瘤細(xì)胞的原發(fā)性惡性腫瘤，多見于青少年，預(yù)后差，危害性極大[1]。由于其對(duì)放射、化學(xué)治療不敏感，治療方法主要是截肢術(shù)，5年生存率為59% ～84%[2]。活性氧（ROS）在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中有重要作用，當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，會(huì)引起DNA氧化損傷及蛋白表達(dá)異常，細(xì)胞功能障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡[3]。臨床廣泛使用相關(guān)藥物直接或間接地通過ROS發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[4]。本研究中分析了ROS通路在硒酸酯多糖誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡中的作用，為尋找藥物干預(yù)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)、發(fā)現(xiàn)潛在的藥物作用靶點(diǎn)以及腫瘤藥物的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1．1 材料

RPMI1640培養(yǎng)基(Gibcol公司)；小牛血清(Hyclone公司)；硒酸脂多糖膠囊（上海天賜福生物工程有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31022699，規(guī)格為每片 0．2 mg）。碘化丙啶染料、吖啶橙、溴乙啶、Tritan X-100（Sigma公司）。人骨肉瘤細(xì)胞株 OS-732(北京積水潭醫(yī)院)。流式細(xì)胞儀FACScalibur（美國(guó)BD公司）、Model550酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-rad公司）。

1．2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)：人骨肉瘤細(xì)胞株OS-732培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，含10%新生小牛血清，青霉素100 U／mL，鏈霉素100 U／mL。37℃，5%CO2傳代培養(yǎng)，取指數(shù)增殖期細(xì)胞備用。0．25%胰酶消化后，稀釋后每孔加100 μL于96孔板，置培養(yǎng)箱中孵育24 h，給予硒酸酯多糖 0，10，20，40，60，120 μg／mL，每1劑量設(shè) 3個(gè)復(fù)孔，以未加藥的細(xì)胞組為陰性對(duì)照，培養(yǎng)12，24，48 h。

四氮唑鹽(MTT)法測(cè)定OS-732增殖活性：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度至 1×106個(gè)細(xì)胞 ／mL。每孔加入 10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 000 r／min離心10 min，棄上清液，每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570 nm（630 nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光度值。增殖抑制率(%)=（1-試驗(yàn)組 OD值／對(duì)照組 OD值）×100%。

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡情況：收集懸浮細(xì)胞直接收集到10 mL的離心管中，每個(gè)樣本有（1～5）×106個(gè)細(xì)胞／mL，1 000 r／min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。用孵育緩沖液洗滌1次，500～1 000 r／min離心 5 min。用 100 μL的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15 min。500～1 000 r／min離心5 min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次。加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不時(shí)振動(dòng)。流式細(xì)胞儀分析：流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)用488 nm，用一波長(zhǎng)為 515 nm的通帶濾器檢測(cè) FITC熒光，另一波長(zhǎng)為560 nm的濾器檢測(cè)PI。

Western分析：收集細(xì)胞，加 200 μL裂解液[50 mmol／L Tris-Hcl pH 8．0，150 mmol／L苯甲基磺酰氟(PMSF)，0．1%乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，蛋白酶抑制劑]。4℃ 12 000 r／min離心15 min，取上清液，采用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度；取上述制備的蛋白樣品50 μg上樣到15%SDS-PAGE凝膠，電泳完畢后將蛋白電轉(zhuǎn)至NC膜，用5%脫酯奶粉封閉，分別加一抗，37℃孵育2 h，經(jīng)0．1%TBST漂洗后加二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X線膠片定影，掃描后用IPP6．0進(jìn)行圖像分析。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

采用不同濃度的硒酸酯多糖作用12，24，48 h后，OS-732細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度抑制，呈時(shí)間和濃度依賴性，在 60 μg／mL濃度處理48 h時(shí)OS-732細(xì)胞抑制率最高，與對(duì)照組細(xì)胞相比，各組生長(zhǎng)抑制率均有顯著性差異（P＜0．05），見表1和圖1。

表1 OS-732細(xì)胞在不同硒酸酯多糖處理?xiàng)l件下的吸光度（）

表1 OS-732細(xì)胞在不同硒酸酯多糖處理?xiàng)l件下的吸光度（）

注：與對(duì)照組比較， P＜0．05， P＜0．01。下表同。

質(zhì)量濃度( g／mL) 0 10 20 40 60 120 12 h 0．35±0．02 0．31±0．01 0．27±0．02 0．25±0．01 0．22±0．02 0．20±0．01 24 h 0．47±0．02 0．43±0．02 0．38±0．01 0．36±0．03 0．32±0．02 0．26±0．02 48 h 0．62±0．01 0．59±0．01 0．51±0．02 0．40±0．02 0．34±0．01 0．30±0．02

圖1 不同質(zhì)量濃度、時(shí)間硒酸酯多糖對(duì)OS-732細(xì)胞的抑制率

2．2 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞術(shù) Annecxin-FITC／PI雙染檢測(cè) 20，40，60 μg／mL質(zhì)量濃度處理24 h硒酸多糖對(duì)OS-732細(xì)胞凋亡的影響，隨著處理藥物質(zhì)量濃度的增加，ROS水平顯著增加（P＜0．05），OS-732細(xì)胞凋亡率顯著升高，其中早期凋亡細(xì)胞及晚期凋亡細(xì)胞百分比與0 μg／mL相比均有顯著性差異（P＜0．05），見表2和圖2。

表2 硒酸酯多糖對(duì)OS-732細(xì)胞凋亡的影響

圖2 FCM檢測(cè)硒酸酯多糖處理后OS-732細(xì)胞凋亡情況

2．3 Western檢測(cè)結(jié)果

硒酸多糖處理OS-732細(xì)胞24 h后，隨著藥物質(zhì)量濃度的增加 P53、Caspase-9及Bax表達(dá)增加，而Bcl-2的表達(dá)顯著降低（P＜0．05），見圖3。

圖3 不同質(zhì)量濃度組P53，Caspase-9，Bax及Bcl-2的表達(dá)水平

3 討論

骨肉瘤是常見的惡性腫瘤[5]。目前化學(xué)治療的常規(guī)藥物均為細(xì)胞毒性藥物，不良反應(yīng)大，近50%的幸存患兒在抗腫瘤治療后至少承受一個(gè)不良后果，如化學(xué)治療藥物早期表現(xiàn)的血液系統(tǒng)毒性[6]、急性肝臟和腎臟毒性[7]，以及生存期的延長(zhǎng)導(dǎo)致化學(xué)治療毒性增加，均對(duì)患兒的生存質(zhì)量帶來不利影響。

硒酸酯多糖是新型有機(jī)硒化合物，系微量元素硒與天然產(chǎn)物Kappa-卡拉膠合成的含硒生物活性多糖，因其生物利用度高、毒性低成為腫瘤研究的對(duì)象[8]，岳黎敏等[9]采用硒酸酯多糖處理人食管鱗癌 Eca109細(xì)胞，顯示磷酸酯多糖能顯著抑制細(xì)胞增殖，Eca109細(xì)胞凋亡率隨藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)及濃度增加而增高，提示磷酸酯多糖具有抑制增殖，誘導(dǎo)凋亡的作用。魏虎來等[10]采用硒酸多糖處理耐藥株 K562／ADM細(xì)胞顯示其能夠通過下調(diào)mdr1／P-gp表達(dá)逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡抑制。吳興等[11]用硒酸多糖用處理人骨肉瘤細(xì)胞，同樣顯示其能夠顯著誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。

線粒體通路是細(xì)胞凋亡的主要通路之一，通過 Bcl-2家族成員在接受到細(xì)胞內(nèi)的死亡信號(hào)后激活Bcl-2，Bax及Bak等分子，引起線粒體膜通透性改變，跨膜電位丟失，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，P53能與 Bax直接作用，促進(jìn)線粒體通透性的改變，促進(jìn)凋亡。機(jī)體在某些環(huán)境刺激下會(huì)產(chǎn)生ROS，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)蛋白、細(xì)胞器及DNA等相關(guān)生物結(jié)構(gòu)破壞，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。ROS的形成是P53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)的關(guān)鍵步驟[12]。骨肉瘤化學(xué)治療藥物毒副作用大，反復(fù)給藥會(huì)產(chǎn)生耐藥性，復(fù)發(fā)性較高，研究顯示腫瘤對(duì)細(xì)胞凋亡的逃避導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡抵抗是腫瘤耐藥發(fā)生的主要原因之一[13]，細(xì)胞內(nèi)ROS及谷胱甘肽(GSH)還原體系狀態(tài)的平衡與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，因此研究腫瘤細(xì)胞的耐藥性與細(xì)胞內(nèi)ROS水平的關(guān)系，為增強(qiáng)化學(xué)治療藥物的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)提供思路。本研究中采用在不同濃度的硒酸酯多糖處理骨肉瘤OS-732細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度抑制，呈現(xiàn)出時(shí)間和濃度依賴性，提示硒酸酯多糖能顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡與其他研究結(jié)果一致[14]。此外，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平隨硒酸酯多糖的處理濃度增加而顯著升高，P53，Caspase-9及Bax的高表達(dá)亦反映了硒酸多糖的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。

綜上所述，硒酸酯多糖處理骨肉瘤細(xì)胞能夠顯著抑制OS-732細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)凋亡，細(xì)胞內(nèi)高水平的ROS狀態(tài)可能在此過程中有重要作用。

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Role ofP53 M ediated ROS Pathwayin Kappa-Selenocarrageenan Induced Osteosarcoma Tumor Cell ASpoptosis

Lai Xiaodan,Ran Qiwen,Ouyang Jing,Shi Ying
(Department of Pharmacy,The First Affiliated Hospital of The Third Military Medical University,Chongqing,China 400000)

Objective To analyze the role of P53 mediated ROS pathway in Kappa-selenocarrageenan induced osteosarcoma tumor cell apoptosis．M ethods Different concentrations selenocarrageenan were used to treat the OS-732 cells,the expression levels of proliferating cells,apoptosis,ROS level and apoptosis-related proteins in each group were analyzed．Results After selenocarrageenan processing,the OS-732 cell growth inhibition showed varying degrees with a time-and concentration-dependent manner,and 60 g／L concentration for 48 h was the maximum inhibition rate of OS-732;20,40,60 μg／mL after concentrations 24 h,ROS levels were significantly increased(P＜0．05),OS-732 cell apoptosis was significantly increased,and the percentage of early apoptotic cells and late apoptotic cells were significantly different compared with 0 μg／mL(P＜0．05);P53,Caspase-9 Bax expression increased with the increase of drug concentration,while the expression of Bcl-2 was significantly lowered(P＜ 0．05)．Conclusion Kappa-selenocarrageenan can significantly inhibit OS-732 cell proliferation,induce apoptosis,and P53-mediated ROS pathway may play an important role．

kappa-selenocarrageenan;osteosarcoma;cell apoptosis

R285.6；R282.71

A

1006-4931(2015)21-0103-03

來小丹，女，碩士研究生，主管藥師，主要從事藥品采購(gòu)工作，（電話）023-68754953（電子信箱）xiaodan-lai＠sina．com。

2015-05-13；

2015-08-04)