高效液相色譜法測定注射用己酮可可堿中有關物質

杜碧瑩

（廣東省廣州市藥品檢驗所，廣東 廣州 510160）

高效液相色譜法測定注射用己酮可可堿中有關物質

杜碧瑩

（廣東省廣州市藥品檢驗所，廣東 廣州 510160）

目的建立測定注射用己酮可可堿中有關物質的高效液相色譜（HPLC）法。方法色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse plus C8柱（250 mm× 4．6 mm，5 m），流動相A為甲醇-0．544%磷酸二氫鉀溶液（3∶7），流動相B為甲醇-0．544%磷酸二氫鉀溶液（7∶3）梯度洗脫，流速為1．0 mL／min，，檢測波長為272 nm。結果己酮可可堿與各雜質分離良好，與可可堿、茶堿、咖啡因在質量濃度0．4～5．0 g／mL范圍內與峰面積呈良好線性關系，定量限分別為8．5，11．1，28．8，12．6 ng。結論該法專屬性強、靈敏、準確，可用于注射用己酮可可堿有關物質的測定。

注射用己酮可可堿；有關物質；高效液相色譜法

甲基黃嘌呤衍生物己酮可可堿是外周血管抗張劑，可降低外周阻力，改善腦和四肢的血液循環，已作為血管抗張劑用于各種血管性疾病的治療[1-2]。同時，己酮可可堿為磷酸二酯酶抑制藥，能增加細胞內環磷酸腺苷(cAMP)水平，具有免疫調節和抗纖維化等藥理作用[3]。注射用己酮可可堿的質量標準在國外藥典及2010年版《中國藥典》中均無收載，且注射用己酮可可堿的有關物質檢查采用高效液相色譜(HPLC)法，但檢查方法均不完善[4-5]。本研究中對注射用己酮可可堿的已知有關物質（可可堿、茶堿、咖啡因與己酮可可堿）在色譜系統中做了有效分離，建立通過外標法控制已知有關物質，不加校正因子的主成分自身稀釋法控制未知有關物質，方法靈敏度高，可有效控制其產品質量。現報道如下。

1 儀器與試藥

日本島津LC-10AT型高效液相色譜儀（帶DAD檢測器）；Agilent 1200型高效液相色譜儀。可可堿（批號為 101110-201001，純度為99．9%）、茶堿（批號為100121-201104，純度為100．0%）、咖啡因（批號為171015-201010，純度為100．0%）、己酮可可堿（批號為100591-200501，純度為100．0%）對照品均購于中國藥品生物制品檢定所；注射用己酮可可堿（廣東陽江制藥有限公司，批號為 130703 1）；甲醇（色譜純，Merck公司），水為Millipore超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse plus C8柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相A為0．544%磷酸二氫鉀溶液-甲醇（7∶3）；流動相B為0．544%磷酸二氫鉀溶液-甲醇（3∶7），梯度洗脫，0～6 min時 B為 14%，6～13 min時 B 14%→90%，13～30 min時 B為90%，30～38 min時B 90%→14%，38～43 min時B為14%；流速：1．0 mL／min；柱溫：35℃；檢測波長：272 nm；進樣量：20 μL。結果各組分出峰順序依次為可可堿、茶堿、咖啡因與己酮可可堿。己酮可可堿的保留時間約12 min，茶堿峰與咖啡因峰的分離度為4，咖啡因峰與己酮可可堿峰的分離度為23。色譜見圖1。

2．2 溶液制備

取可可堿、茶堿、咖啡因與己酮可可堿對照品各適量，精密稱定，加溶劑[0．544%磷酸二氫鉀溶液-甲醇（1∶1）混合液]溶解并定量稀釋制成每1 mL中各含2 μg的混合溶液，即得對照品溶液。取本品，精密稱定，加溶劑定量稀釋制成每1 mL中約含己酮可可堿1 mg的溶液，即得供試品溶液。

2．3 方法學考察

破壞試驗：為考察己酮可可堿可能的降解產物及色譜條件的選擇性，采用酸、堿、紫外光照及氧化對己酮可可堿進行破壞性處理。結果表明，己酮可可堿對堿、氧化劑較不穩定，出現了明顯的雜質峰，但與主峰均有良好的分離。色譜圖見圖2。

檢測波長確定：用二極管陣列檢測器對上述破壞性試驗樣品的檢測表明，己酮可可堿降解產物的最大吸收波長約為272nm，見表1。

圖1 含量測定高效液相色譜圖

圖2 破壞性試驗高效液相色譜圖

表1 破壞性試驗結果

線性關系考察：取可可堿、茶堿、咖啡因及己酮可可堿對照品適量，分別制成每1 mL中各含0．4～5．0 μg的溶液進行測定，以峰面積(X)為橫坐標、質量濃度(Y)為縱坐標進行線性回歸，回歸方程分別為 Y=0．000 015 534 7 X-0．014 976 5（r=0．999 99，n=6）；Y=0．000 015 185 8 X+0．002 733 1（r=0．999 98，n=6）；Y=0．000 017 248 5 X+0．018 274 2（r=0．999 99，n=6）；Y=0．000 024 759 6 X+0．045 660 6（r=0．999 97，n=6）。結果表明，可可堿、茶堿、咖啡因及己酮可可堿質量濃度在0．4～5．0 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取系統適用性溶液，連續進樣6次，結果可可堿、茶堿、咖啡因及己酮可可堿峰面積變化的 RSD分別為0．30，0．20，0．40和0．40（n=6），表明儀器精密度良好。

定量限確定：按信噪比（S／N）為10∶1計，可可堿、茶堿、咖啡因與已酮可可堿定量限分別為8．50，11．10，28．80，12．60 ng。

重復性試驗：取同一樣品，依法制備6份供試品溶液并測定含量。結果的 RSD為1．30%（n=6），表明方法重復性好。

穩定性試驗：取樣品適量，依法制備供試品溶液，于0，2，6，10，24 h時取樣測定。結果的 RSD為1．80%（n=5），表明供試品溶液在24 h內穩定。

2．4 有關物質檢查

結果見表2。

3 討論

檢測波長選擇時，由合成工藝可見，可可堿為反應原料，茶堿則為可可堿的同分異構體。利用DAD掃描190～400 nm測定并提取各色譜紫外分光色譜（UV）圖。結果顯示，選擇272 nm為檢測波長，己酮可可堿、可可堿、茶堿、咖啡因與弱極性的聚合物等合成帶來的雜質及貨架期的降解產物均可檢測。

表2 有關物質含量測定結果（%）

國家藥品標準中有關物質檢查項下，采用甲醇-水-醋酸（32∶68∶0．5）作為流動相，等度洗脫，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。對已知有關物質及其余單個有關物質沒有明確的規定，只計算總有關物質的量（1．0%）。從樣品檢測對比結果來看，國家標準檢出雜質的個數少，雜質總量只有0．08%。該法有關物質的限度修訂為已知雜質可可堿、茶堿與咖啡因按外標法計算。由表2可見，有關物質檢查結果均不大于0．2%，其他單個雜質峰面積不大于對照品溶液中己酮可可堿的峰面積（0．2%），雜質總量不過1．0%。

比較了3個不同牌號色譜柱，以柱效、主峰的保留時間、對樣品雜質的分離效能等綜合指標評價，色譜柱均適用。該法專屬性強，己酮可可堿與各雜質峰的分離度均符合要求，可更好的控制產品的質量。該法專屬性強、靈敏、準確，可用于注射用己酮可可堿有關物質的測定。

[1]楊麗紅．己酮可可堿治療急性腦梗塞 58例[J]．中國藥業，2007，16（1）：58．

[2]郝 嘉，郭 紅，肖穎彬．己酮可可堿的藥理特性和臨床新用途[J]．中國新藥與臨床雜志，2002，21（3）：183-186．

[3]張詞俠，張桂林，李志勇，等．己酮可可堿的藥理特性和治療用途的研究進展[J]．中國臨床藥理學雜志，2008（1）：74-77．

[4]WS1-（X-106）-2005-2006Z．國家藥品標準[S]．

[5]尹德忠，吳耀國，趙紅俠．注射用己酮可可堿中己酮可可堿含量及有關物質的高效液相色譜法測定 [J]．分析儀器，2007(4)：54-57．

Determination of Related Substances in Pentoxifylline for Injection by HPLC

Du Biying
(Guangzhou Institute for Drug Control,Guangzhou,Guangdong,China 510160)

Objective To establish an HPLC gradient elution method for the determination of related substances in pentoxifylline for injection．M ethods Agilent Zorbax Eclipse plus C8column (250 mm×4．6 mm,5 μm)was used,the methanol-0．544% solution of potassium dihydrogen phosphate(3∶7)as mobile phase A,and a mixture of methanol-0．544% solution of potassium dihydrogen phosphate-(7∶3)as mobile phase B．The detection wavelength was 272 nm and the flow rate 1．0 mL／min for the gradient elute．Results Pentoxifylline and its related substances can be separated effectively by this method．The concentration-response relationship was linear over the range of 0．4-5．0 μg／mL and the limit of detection were 8．5,11．1,28．8,12．6 ng．Conclusion The HPLC method is specific,accurate and sensitive which may be used for the inspection of related substances in pentoxifylline for injection．

Pentoxifylline for Injection;related substances;HPLC

R927.2；R972+.4

A

1006-4931(2015)21-0123-03

杜碧瑩，碩士研究生，副主任藥師，研究方向為化學藥品檢驗，(電子信箱)winddby＠tom．com。

2014-11-13；

2015-04-24)