內質網應激在羅哌卡因誘導SH-SY5Y細胞凋亡中的作用

馮亮群

(河南省洛陽市婦女兒童醫療保健中心麻醉科，河南 洛陽 471000)

內質網應激在羅哌卡因誘導SH-SY5Y細胞凋亡中的作用

馮亮群

(河南省洛陽市婦女兒童醫療保健中心麻醉科，河南 洛陽 471000)

目的 探討內質網應激在羅哌卡因誘導SH-SY5Y細胞凋亡中的作用。方法 羅哌卡因組采用3 mmol／L羅哌卡因處理SH-SY5Y細胞，阻斷組采用10 mol／L SB203580及3 mmol／L羅哌卡因處理SH-SY5Y細胞。分析各組細胞增殖活性、凋亡，活性氧簇（ROS）及p38MAPK水平。結果 與對照組比較，細胞存活率羅哌卡因組顯著降低（t=5.29，P＜0.05），阻斷組較羅哌卡因組顯著升高，但顯著低于對照組（t=3.18，t=4.96，P＜0.05）；羅哌卡因組細胞凋亡率較對照組及阻斷組顯著升高（F=125.16，P＜0.05）；羅哌卡因組細胞內的ROS水平顯著升高（P＜0.05），阻斷組ROS水平較對照組高（P＜0.05）但顯著低于羅哌卡因組（P＜0.05）；各組p38MAPK水平差異無統計學意義（P＞0.05），羅哌卡因組p-p38MAPK顯著升高，阻斷后表達水平降低（P＜0.05）。結論 羅哌卡因處理SH-SY5Y細胞能誘發細胞內ROS的蓄積，抑制細胞增殖活性，促進凋亡，p38MAPK通路的激活在誘導凋亡的過程中有重要作用。

活性氧簇；羅哌卡因；SH-SY5Y；細胞凋亡

隨著局部麻醉藥（簡稱局麻藥）在椎管內麻醉的廣泛應用，其安全性及可能存在的神經毒性越來越引起學者的關注[1]。局麻藥的神經毒性主要表現以神經纖維或脊髓初級神經元的損傷為主，包括暫時性神經病學綜合征（transient neurological syndrome，TNS）[2]及馬尾神經綜合征（cauda equine syndrome，CES）[3]。局麻藥用于椎管內或區域神經阻滯，可直接作用于神經元，破壞其氧化磷酸化，干擾線粒體跨膜電位[4]，促進神經元程序性死亡。多項研究表明，羅哌卡因能觸發神經元細胞內活性氧簇（ROS）暴發，在神經毒性機制中有重要的作用[5]。筆者分析了p38MAPK途徑在羅哌卡因誘導SH-SY5Y細胞凋亡中的作用，為預防臨床羅哌卡因引起的神經毒性及開發有效的治療藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM／F12培養基、FBS（Gibco公司）；鹽酸羅哌卡因（AstraZeneca公司）；細胞凋亡試劑盒、噻唑藍(MTT)、p38MAPK、p-p38MAPK及 GAPDH抗體（Abcam公司）；SH-SY5Y細胞株（中科院上海生命科學研究院細胞資源中心）。

1.2 方法

細胞培養復蘇：置SH-SY5Y細胞株于含有15%FBS、青霉素100 U／mL、鏈霉素100 μg／mL的DMED／F12培養基，于37℃及5%CO2培養箱中培養2 d，細胞貼壁后分組處理細胞。將SH-SY5Y細胞隨機分為3組，即對照組（無血清培養基培養30 h），羅哌卡因組（3 mmol／L羅哌卡因＜國藥準字H20050325，廣東華潤順峰藥業有限公司＞），無血清培養基培養30 h）及阻斷組（3 mmol／L羅哌卡因+10 μmol／L SB203580，無血清培養基培養30 h）。

細胞內ROS檢測：將各組細胞培養液用胰酶消化細胞后，按1∶1 000用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋熒光探針DCFH-DA，按終濃度10 μL／L加入DCFH-DA于培養液中，37℃培養箱中孵育20 min，用 PBS洗去多余未進入細胞的DCFH-DA，制成單細胞懸液。以激發光波長488 nm、發射波長524 nm、FCM檢測各組細胞內熒光強度。

MTT法檢測細胞存活率：收集各組細胞，調節細胞懸液濃度至1×106／mL。每孔加入MTT溶液10 μL，繼續培養4 h。1 000 r／min離心10 min，棄上清液，每孔加入DMSO 100 μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀 OD570（630 nm校準）測量各孔的 OD值。增殖抑制率=（1-OD試驗組／OD對照組）× 100%。

流式細胞術測定細胞凋亡情況：收集細胞，用100 μL的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10～15 min。500～1 000 r／min離心5 min，沉淀細胞，孵育，緩沖液洗1次。加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不時振動。流式細胞儀激發光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長為560 nm的濾器檢測PI。

Western bolt法分析細胞p38MAPK等蛋白表達水平：加200 μL裂解液（50 mmol／L Tris-HCl pH 8.0，150 mmol／L PMSF，0.1% NP-40，蛋白酶抑制劑），4℃12 000 r／min離心15 min，取上清液，采用Bradford法檢測蛋白濃度。取上述制備的蛋白樣品50 μg，上樣到15%SDS-PAGE凝膠，電泳完畢后將蛋白電轉至NC膜，用5%脫脂奶粉封閉，分別加一抗，37℃孵育2 h，經0.1%TBST漂洗后加二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X線膠片定影，掃描后用IPP 6.0進行圖像分析。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 對SH-SY5Y細胞增殖的抑制作用

MTT檢測顯示，與對照組比較，羅哌卡因組細胞存活率顯著降低（t=5.29，P＜0.05），阻斷組細胞存活率較羅哌卡因組顯著升高，但顯著低于對照組（t=3.18，t=4.96，P＜0.05），見圖1。

圖1 MTT檢測各組細胞增殖活性

2.2 對SH-SY5Y細胞凋亡的影響

采用流式細胞術Annecxin-FITC／PI雙染檢測各組SH-SY5Y細胞凋亡率，結果顯示，羅哌卡因組細胞凋亡率為(37.15± 7.02)%，較對照組的(5.16±1.25)%及阻斷組的(14.91±5.11)%顯著升高（F=125.16，P＜0.05）。

2.3 對SH-SY5Y細胞ROS及p-p38MAPK的影響

與對照組比較，羅哌卡因組細胞內的ROS水平顯著升高（P＜0.05），阻斷組升高（P＜0.05）但顯著低于羅哌卡因組（P＜0.05），見圖 2。p38-MAPK在各組間差異無統計學意義（P＞0.05），但在羅哌卡因組，p-p38MAPK顯著升高，阻斷后表達水平降低（P＜0.05），見圖3。

圖2 各組細胞內ROS水平

圖3 Western blot法分析各組p38MAPK表達水平

3 討論

羅哌卡因的結構特征和藥理特性與布比卡因類似，但心血管和中樞神經系統毒性均較布比卡因低[6]，廣泛應用于蛛網膜下腔阻滯麻醉，具有低濃度時感覺-運動神經分離現象突出的優點[7]。相同濃度、劑量的羅哌卡因和布比卡因用于蛛網膜下腔阻滯時，運動神經阻滯起效時間羅哌卡因慢且弱[8]。羅哌卡因能可逆地減少神經纖維膜對鈉離子的通透性，減慢去極化的速度，提高應激閾值，優先阻滯感覺纖維，使運動神經纖維輕微阻滯。但由于羅哌卡因與血漿蛋白結合率低，脂溶性差，對神經膜、神經鞘膜及血腦屏障的穿透弱、蓄積能力差[9]。

過氧化物、DNA損傷及鈣離子自穩態等因素均能誘導神經細胞凋亡，神經細胞在進入 DNA降解前，線粒體功能發生紊亂，內膜跨膜電位消失，激活凋亡相關代謝改變[10]。ROS暴發是導致神經細胞急性損傷的主要因素之一，其在細胞內累積，破壞細胞內氧化還原的動態平衡，損傷線粒體膜，還可與核酸、蛋白直接發生作用使其功能發生抑制。研究顯示，p38MAPK途徑在神經細胞凋亡中有重要作用[11]。本研究中采用羅哌卡因處理SH-SY5Y細胞，結果顯示，細胞內的ROS水平顯著升高，細胞的增殖活性降低，凋亡率升高；經p38MAPK阻斷劑SB203580阻斷后，細胞的增殖活性及凋亡率均較羅哌卡因處理組顯著改善。由圖3可知，各組間p38MAPK的表達無顯著性差異，但磷酸化的p38MAPK的表達差異顯著，p-p38MAPK是其活化形式，其表達升高提示p38MAPK通路的激活。神經細胞損傷時存在ROS的蓄積[12]，如羥自由基、超氧陰離子等造成神經組織氧化應激狀態[13]，參與神經損傷的發生發展。ROS作為第二信使，激活包括MAPK在內的信號轉導通路，使絲氨酸／蘇氨酸激酶信號級聯活化，造成神經細胞損傷。

綜上所述，羅哌卡因處理SH-SY5Y細胞能誘發細胞內ROS的蓄積，抑制細胞增殖活性，促進凋亡，且p38MAPK通路的激活在誘導凋亡的過程中有重要的作用。

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The Role of Endoplasmic Reticulum Stress in Ropivacaine Inducing SH-SY5Y Cell Apoptosis

Feng Liangqun
(Anesthesiology Department,Luoyang Women and Children Health Care Center,Luoyang,Henan,China 471000)

Objective To analyse the role of endoplasmic reticulum stress in ropivacaine inducing SH-SY5Y cell apoptosis.M ethods The ropivacaine group was given 3 mmol／L ropivacaine to treat SH-SY5Y cells，the blocking group was given 10 μmol／L SB203580 and 3 mmol／L ropivacaine.Cell proliferation，apoptosis，ROS and p38MAPK levels were analyzed.Results Compared with the control group，the cell survival rate of the ropivacaine group after treatment was significantly reduced(t=5.29，P＜0.05)，the cell survival rate of the blocking group was significantly higher than the ropivacaine group，but significantly lower than the control group(t=3.18，t=4.96，P＜0.05);apoptosis rate in the ropivacaine group was higher than the control group and the blocking group(F=125.16，P＜0.05); The ROS levels in ropivacaine group were significantly increased(P＜0.05)，ROS levels in blocking group was higher than the control group(P＜0.05)，but significantly lower than the ropivacaine group(P＜0.05);the difference of p38MAPK in each group has no statistical significance(P＞0.05)，but p-p38MAPK was significantly higher in the ropivacaine group and the level of which in the blocking group deceased(P＜0.05).Conclusions Ropivacaine in treating SH-SY5Y cells can induce intracellular ROS accumulation, inhibit cell proliferation，induce apoptosis，and plays an important role in activating p38MAPK pathway.

ROS;ropivacaine;SH-SY5Y;cell apoptosis

R965；R971+.2

A

1006-4931(2015)17-0013-03

馮亮群（1968-），女，大學本科，副主任醫師，主要從事臨床麻醉工作，（電子信箱）flq_681122＠163.com。

2015-03-13)