Survivin、Fhit蛋白在喉癌組織中的表達及臨床意義

吳春芳，李玲香，李海洲，李 富，米玉錄

腫瘤的發生是多因素共同作用的結果，正常細胞轉變為癌細胞，并浸潤到鄰近組織或轉移到遠隔器官是一個復雜的基因突變的過程，癌基因的激活和抑癌基因的失活等在腫瘤的發生、發展中起著重要的作用，癌基因是指能導致細胞惡性轉化的核苷酸片斷［1］。抑癌基因是一類可抑制細胞生長并有潛在抑制癌變作用的基因［2］。越來越多的研究表明除各因素的獨立致癌作用外，它們之間還可能通過某種復雜的相互作用關系影響惡性腫瘤的發生發展。本實驗選擇在喉癌形成過程中可能起反作用的抑癌基因脆性組氨酸三聯體基因(fragile histidine traid，Fhit)和凋亡抑制基因存活素(Survivin)進行研究。以探討其在喉鱗癌的發生、發展及轉移中的作用，并分析其間存在的相互關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選用內蒙古醫學院一附院、山西醫科大學腫瘤醫院2006年10月—2007年8月、包頭醫學院第一附屬醫院2008年7月—2013年12月經手術治療并病理證實的92例喉鱗癌標本(喉癌組)及相應癌旁組織(距離癌邊緣10 mm，癌旁組)，25例喉正常黏膜(正常組)來自92例全喉切除喉癌患者及喉癌修喉過程中修剪的正常黏膜。喉癌組:男80例，女12例。病理分級:高分化45例，中分化30例，低分化17例;病理檢查均為鱗狀細胞癌，有淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移67例;按國際抗癌協會(UICC)1997年分級標準:Ⅰ+Ⅱ期27例;Ⅲ+Ⅳ期65例;所有患者術前均未行放療或化療。

1.2 方法 手術切除的組織標本均經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片、HE染色，連續切片每張厚4μm，采用免疫組化鏈霉卵白素-生物素復合體(strep avidin-biotin complex，SABC法)，二氨基聯苯胺(diamionben zidene，DAB)顯色。兔抗人多克隆抗體Fhit購自北京中杉金橋生物技術開發公司，兔抗人多克隆抗體Survivin、SABC即用型試劑盒、DAB顯色試劑均購自武漢博士德生物技術開發公司，實驗步驟嚴格按試劑盒說明書進行，將PBS代替一抗作陰性對照，試劑公司提供陽性對照，Fhit蛋白采用正常乳腺組織，Survivin蛋白采用乳腺癌組織。

1.3 結果判定 顯微鏡下觀察表達情況:在100倍視野下，觀察比較不同部位的染色強度。Survivin蛋白［3-4］與Fhit蛋白染色陽性細胞以胞漿呈黃色至棕黃色為主，偶見胞核表達。染色強度評分:0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。在400倍視野下，每例隨機選取5個不重復視野，計數每個視野中陽性細胞所占百分比并計分。陽性細胞百分比評分:0分為陰性，1分為陽性細胞≤10%，2分為11% ～50%，3分為51% ～75%，4分為 ＞75%。采取二次計分法［5］:染色強度與百分比的乘積＞3分為免疫反應陽性。

1.4 統計學處理 結果采用SPSS 15.0統計軟件包進行統計學處理，樣本率間比較用χ2檢驗，相關關系的分析采用Spearman等級相關分析法。ɑ=0.05作為檢驗水準。

2 結果

2.1 Survivin、Fhit在喉癌、癌旁組織及正常喉黏膜的表達 喉癌組Survivin陽性率76.09%(圖1)，癌旁組Survivin陽性率為13.04%，兩者有顯著性差異(χ2=74.01，P=0.00);正常組 Survivin表達陽性率為8.00%，與喉癌組比較有顯著性差異(χ2=38.51，P=0.00)，與癌旁組無顯著性差異(χ2=0.47，P=0.15)。喉癌組Fhit陽性率為43.48%(圖2)，癌旁組Fhit陽性率為86.96%，兩者有顯著性差異(χ2=38.33，P=0.00)，正常組 Fhit表達陽性率為92.00%，與喉癌組有顯著性差異(χ2=18.62，P=0.00)，與癌旁組無顯著性差異(χ2=0.12，P=0.73)，見表 1。

表1 Survivin、Fhit在喉癌、癌旁組織及正常喉黏膜的表達

2.2 Survivin、Fhit表達與喉癌臨床病例參數的關系 Survivin與臨床分期有關(P＜0.05)，與淋巴結轉移、分化程度、年齡無顯著性差異(P＞0.05);Fhit與淋巴結轉移和臨床分期有關(P＜0.05)，與分化程度、年齡無顯著性差異(P＞0.05)，見表2。

2.3 Survivin和Fhit表達的相關性 在喉癌組織中，Fhit和Survivin均陽性20例，均陰性2例，Fhit陽性Survivin陰性20例，Fhit陰性Survivin陽性50例。Fhit和 Survivin有相關性(r=-0.54，P＜0.05)，兩者呈負相關。

3 討論

Survivin基因是1997年耶魯大學Altieri等［6］在人類基因組文庫中篩選出的一種結構獨特的哺乳類凋亡抑制蛋白(IAP)，是迄今發現的、作用最強的凋亡因子之一，它的表達具有高度的特異性，除胎盤和胸腺組織外，在正常成熟組織不表達或低表達，而在多種腫瘤組織中表達［7-10］。Survivin可直接作用于Caspase，主要通過黏附于活化的Caspase-3、-7參與細胞凋亡的執行，調節染色體的分離和胞質的分裂，從而阻斷凋亡的過程，使腫瘤細胞逃逸G2/M檢測關卡而獲得惡性增殖潛能［11］。本組實驗結果表明，喉鱗狀細胞癌組織中Survivin的表達與癌旁及正常組織中的表達均有顯著性差異，癌旁及正常組織中的表達陽性率分別為13.04%與8%，癌旁組表達高于正常組，但無統計學意義。喉癌Ⅰ～Ⅱ期其表達率明顯低于Ⅲ～Ⅳ期，差異有統學意義。與淋巴結轉移、分化程度、年齡無顯著性差異，與Kato等［12］在食管癌組織中Survivin表達的研究結果一致。其他學者對Survivin的研究認為其表達與喉癌臨床分期、分化程度及淋巴結轉移相關［13-14］。

表2 喉癌組織中Fhit、Survivin的表達與臨床病理參數的關系

圖1 Survivin在喉癌組織中高表達(SABC×100)

圖2 Fhit在喉癌組織中低表達(SABC×100)

Fhit基因是1996年Ohta等［15］用定位克隆及外顯子捕獲技術在3P14.2首先克隆出來的，主要通過參與細胞周期調控和凋亡發揮作用，可使細胞受阻于增殖周期的S期，并激活Caspase-8、Caspase-9引起Caspase酶介導的凋亡級聯反應［16］。其存在于人類所有正常組織，在許多腫瘤組織中或腫瘤細胞株中呈現多發性，廣泛性的純合性或雜合性缺失，提示該基因的異常可能和腫瘤的發生有關，尤其是多見于與致癌物暴露相關的腫瘤，如肺癌、喉癌、食管癌、胃癌等［17-20］。Sozzi等［21］證實畸變的 Fhit基因轉錄產物和異常的免疫反應產物之間有顯著相關性，即Fhit蛋白表達缺失與基因異常具有顯著相關性，提示對腫瘤標本進行免疫組化分析來檢測Fhit基因的改變是簡便而可靠的。本組實驗結果表明，喉癌中Fhit的表達與癌旁及正常組織中的表達均有顯著性差異，癌旁及正常組織中的表達陽性率分別為86.96%與92.00%，癌旁組表達低于正常組，但無統計學意義。喉癌Ⅰ～Ⅱ期其總缺失率明顯低于Ⅲ～Ⅳ期的，而淋巴結有轉移和無轉移相比，差異有統學意義。與分化程度、年齡無顯著性差異，說明Fhit蛋白表達缺失與臨床分期和淋巴轉移有關。與趙坡等的研究一致［22-25］。

研究表明Fhit和Survivin都參與了Caspase凋亡途徑，而且都參與細胞周期的調控，但生物學效應相反。本實驗通過分析Fhit蛋白、Survivin蛋白在癌組織中的表達關系，表明當癌組織既有Survivin蛋白過量表達，又存在Fhit蛋白不表達或表達降低時，其組織學分化程度降低，臨床分期級別加大，二者表達呈負相關。由此推測，Survivin蛋白高表達和Fhit蛋白低表達在喉癌的發生、發展上可能有協同作用。因此，采用免疫組化方法聯合檢測二者的異常表達有助于對可疑癌進行早期診斷，并對腫瘤惡性程度、患者的病情及預后做出正確的評價以及制定合理的治療方案，故可能成為新的分子指標用于臨床。

［1］ 江培洲，沈新明.癌基因與抑癌基因的表達研究進展［J］.國外醫學腫瘤學分冊，2001，28(2):89-92.

［2］ 鄧艷春，藥立波，蘇成芝，等.抑癌基因研究進展［J］.國外醫學分子生物學分冊，2001，23(5):27l-274.

［3］ Badran A，Yoshida A，Ishikawa K，et al.Identification of a novel splice variant of the human anti-apoptosis gene survivin［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，314(3):902-907.

［4］ Okada E，Murai Y，Matsui K，et al.Survivin expression in tumor cell nuclei is predietive of a favorable prognosis in gastriec cancer patients［J］.Cancer Lett，2001，163(1):109-116.

［5］ 許良中，楊文濤.免疫組織化學反應結果的判斷標準［J］.癌癥雜志，1996，5(4):229-23l.

［6］ Ambrosini G，Adida C，Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma［J］.Nat Med，1997，3(8):917-921.

［7］ Khanna N，Sen S，Sharma H，et al.S29 ribosomal protein in-duces apoptosis in H520 cells and sensitizes them to chemotherapy［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，304(1):26-35.

［8］ Sarela A I，Macadam R C，Farmery SM，et al.Expression of the antiapoptosis gene，survivin，predicts death from recurrent colorectal carcinoma［J］.Gut，2000，46(5):645-650.

［9］ Chen X Q，Yang S，Li Z Y，et al.Effects and mechanism of downregulation of survivin expression by RNA interference on proliferation and apoptosis of lung cancer cells［J］.Mol Med Rep，2012，5(4):917-922.

［10］ Roca H，Craig M J，Ying C，et al.IL-4 induces proliferation in prostate cancer PC3 cells under nutrient-depletion stress through the activation of the JNK-pathway and survivin upregulation［J］.J Cell Biochem，2012，113(5):1569-1580.

［11］王孝養，張珍祥.survivin與腫瘤細胞凋亡［J］.中華病理學雜志，2002，31(1):68-69.

［12］ Kato J，Kuwabara Y，Mitani M，et al.Expression of survivin in esophageal Cancer:correlation with the prognosis and response to chemotherapy［J］.Int JCancer，2001，95(2):92-95.

［13］朱瑾，徐如君，吳正虎，等.喉鱗狀細胞癌組織中Survivin基因與p15和p16基因表達的關系［J］.中華耳鼻咽喉科雜志，2004，39(6):356-359.

［14］王吉哲，關超，王壽忱，等.Survivin蛋白在喉鱗狀細胞癌中的表達及意義［J］.臨床耳鼻咽喉科雜志，2005，19(6):247-249.

［15］Ohta M，Inoue H，Cotticelli M G，et al.The FHIT gene，spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t(3;8)breakpoint，is abnormal in digestive tract cancers［J］.Cell，1996，84(4):587-597.

［16］ Pekarsky Y，Zanesi N，Palamarchuk A，et al.FHIT:from gene discovery to cancer treatment and prevention［J］.Lancet-Oncol，2002，3(12):748-754.

［17］Jiang F，Todd N W，Li R，et al.A panel of sputumbased genomic marker for early detection of lung cancer［J］.Cancer Prev Res(Phila)，2010，3(12):1571-1578.

［18］ Paluszczak J，Misiak P，Wierzbicka M，et al.Frequent hypermethylation of DAPK， RARbeta， MGMT，RASSF1A and FHIT in laryngeal squamous cell carcinomas and adjacent normal mucosa［J］.Oral Oncol，2011，47(2):104-107.

［19］ Sun J，Liu J，Pan X，et al.Effect of zinc supplementation on N-nitrosomethylbenzylamine-induced forestomach tumor development and progression in tumor suppressordeficient mouse strains［J］.Carcinogenesis，2011，32(3):351-358.

［20］ Czyzewska J，Guzińska-Ustymowicz K，Pryczynicz A，et al.Immunohistochemical assessment of Fhit protein expression in advanced gastric carcinomas in correlation with Helicobacter pylori infection and survival time［J］.Folia Histochem Cytobiol，2009，47(1):47-53.

［21］ Sozzi G，Tornielli S，Tagliabue E，et al.Absence of Fhit protein in primary lung tumors and cell lines with FHIT gene abnormalitie［J］.Cancer Res，1997，57(23):5207-5212.

［22］趙坡，李曉瑛，陳樂真.乳腺癌中Fhit蛋白的低表達與轉移的關系［J］.癌癥，2002，21(6):668-670.

［23］ Yoshino K，Enomoto T，Nakamura T，et al.FHIT alterations in cancerous and non-cancerous cervical epithelium［J］.Int J Cancer，2000，85(1):6-13.

［24］ Shimada Y，Sato F，Watanabe G，et al.Loss of fragile histidine triad gene expression is associated with progression of esophageal squamous cell carcinoma，but not with the patient＇s prognosis and smoking history［J］.Cancer，2000，89(1):5-11

［25］殷德濤，盧秀波，董明敏，等.喉鱗癌組織中FHIT表達與細胞增殖、轉移的關系［J］.癌癥，2004，23(11):1338-1341.