阿托伐他汀預處理對缺血再灌注小鼠心肌微血管內皮屏障的保護作用*

趙世杰　齊國先　田　文　史立業　陳　玲　盧彥昭

阿托伐他汀預處理對缺血再灌注小鼠心肌微血管內皮屏障的保護作用*

趙世杰齊國先#田文史立業陳玲盧彥昭

【摘要】目的：探討阿托伐他汀預處理對缺血再灌注小鼠心肌微血管血流灌注和滲透性的作用及其機制。方法：60只昆明小鼠隨機分為6組：假手術組(C組)、缺血組(I組)、再灌注組(I/R組)、再灌注前2h阿托伐他汀10mg/kg灌胃組(A102組)、再灌注前2h阿托伐他汀20mg/kg灌胃組(A202組)、再灌注前2h阿托伐他汀20mg/kg灌胃+再灌注前15min L-NAME(N-硝基-L-精氨酸甲酯)15mg/kg尾靜脈注射組(AL202組)，每組均10只小鼠。于光鏡下結扎冠脈制備心肌缺血再灌注模型，以活體冷凍技術(IVCT)摘取心臟，其中5只小鼠心臟行冷凍置換、石蠟包埋，之后切片行HE染色及Albumin免疫組織化學染色，并對間質中的Albumin免疫組織化學染色強度進行半定量分析；另5只小鼠采用 Western Blotting檢測心肌組織內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、黏附連接蛋白VE-cadherin和緊密連接蛋白Claudin-5的表達水平。 結果：與I組及I/R組相比，A202組小鼠心肌細胞界限較清晰，降落傘型紅細胞的頂端指向血流方向，Albumin無明顯向間質等部位滲漏。A102組鏡下所見與A202組類似，但微血管內紅細胞數量、形態及心肌細胞界限清晰度等不及A202組，Albumin向間質滲漏。AL202組可見心肌細胞腫脹，微血管內紅細胞減少、缺如，但微循環血流灌注好于I/R組，Albumin滲漏少于I/R組。與I組和I/R組對比，A202組和A102組心肌組織中eNOS蛋白表達均明顯升高(P<0.01)，尤以A202組最為明顯(P<0.05)。與A202組相比，AL202組eNOS蛋白表達降低(P<0.05)，且與I/R組差異無統計學意義(P>0.05)。與C組相比，I組和I/R組VE-cadherin蛋白和Claudin-5蛋白表達顯著降低(P<0.05)，而A102和A202組VE-cadherin蛋白和Claudin-5蛋白表達較I組和I/R組明顯升高(P<0.05)，尤以A202組升高最為明顯(P<0.05)。AL202組VE-cadherin及Claudin-5蛋白水平較I/R組升高(P<0.05)。結論：再灌注前短時間內大劑量阿托伐他汀預處理可改善缺血再灌注心肌微循環血流灌注及微血管滲透性，其機制可能不完全依賴于eNOS/NO途徑。

【關鍵詞】阿托伐他汀；缺血再灌注；微循環；血管滲透性；活體冷凍技術；小鼠

The Protective Effect of Atorvastatin on Microvascular Barrier in Myocardial Ischemia Reperfusion Injury*

ZHAO Shi-jie, QI Guo-xian#, TIAN Wen, SHI Li-ye, CHEN Ling, LU Yan-zhao

Department of Geriatric Cardiology, The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China；#Corresponding author

【Abstract】Objective: To explore the effect and the probably mechanism of atorvastatin pretreatment before ischemia-reperfusion on epicardial microvascular blood flow and microvascular permeability. Method: 60 mice divided into 6 groups randomly: sham-operated group(C), ischemia group(I), ischemia-reperfusion group(I/R), atorvastatin 10mg/kg gavage 2h before reperfusion group(A102), atorvastatin 20mg/kg gavage 2h before reperfusion group(A202), atorvastatin 20mg/kg gavage 2h before reperfusion+L-NAME 15mg/kg tail vein injection 15min before reperfusion group(AL202). The myocardial ischemia reperfusion model was prepared under light microscopy. IVCT

[作者單位]中國醫科大學附屬第一醫院老年心血管內科， 沈陽110001；#通訊作者，Tel：024-83282300；E-mail：qigx2002@medmail.com.cn

本文2015-08-20收到，2015-09-29修回

followed by freeze-substitution fixation was used to prepare the heart sample of half of the mice in each group, and then stained with hematoxylin-eosine (HE) and albumin antibody for light microscopy observation. The heart samples of another half of each group were prepared for the expression test of eNOS, VE-cadherin and Claudin-5 by Western Blotting. Results: Compared with I and I/R group, A202 group showed the structure of microenvironment was more clear, the apiculus of parachute-shape erythrocytes directed the orientation of blood flow, and less leakage of albumin in the blood vessel. A102 group showed a similar effect, but less than A202 group. In AL202 group, the slices showed myocardial microvascular slightly narrow and myocardial cell swelling, but the blood flow and leakage of plasma albumin is still less than I/R group. Compared with I and I/R group, the expression level of eNOS in A202 and A102 group were significantly increased (P<0.01), especially in A202 group (P<0.05).Compared with A202 group, the expression level of eNOS in AL202 group reduced significantly (P<0.05), and there was no statistically significant difference with I/R group (P>0.05).Compared with C group, the expression level of VE-cadherin and Claudin-5 significantly reduced (P<0.05). Meanwhile, compared with I and I/R group, the expression level of VE-cadherin and Claudin-5 increased significantly in A102 and A202 group (P<0.05), especially in A202 group (P<0.05). Furthermore, compared with I/R group, the expression level of VE-cadherin and Claudin-5 were also increased in AL202 group (P<0.05). Conclusion: High dose atorvastatin pretreatment 2h before reperfusion can significantly improve the blood flow state and the plasma albumin leakage in microvascular, and the mechanism may related to the protection effect of atorvastatin on microvascular endothelial cell junction proteins such as VE-cadherin and Claudin-5, which probably does not totally depend on the eNOS/NO pathway.

【Key words】Atorvastatin； Ischemia reperfusion； Microcirculation； Microvascular permeability； In vivo cryotechnique (IVCT)； Mice

缺血再灌注損傷(Ischemic Reperfusion Injury，IRI)是困擾臨床的重大難題。心臟再灌注過程中，冠脈血管內皮屏障受損、滲透性增加是損傷的主要始動因素，而病理性的微血管滲透性增加主要由內皮細胞間緊密連接和黏附連接處的細胞間黏附分子來調節[1]。近年來，一系列研究證實他汀類藥物可能直接保護內皮細胞間緊密連接及黏附連接組分，從而在內皮屏障調節中起關鍵作用[2]。然而，目前大部分使用他汀類藥物防治IRI的研究都是在缺血或再灌注前12h或數天給予他汀類藥物治療[4]，這種給藥方式在急性心肌梗死的再灌注治療中仍有很大的局限性。有研究[4]表明，在心臟移植過程中，于移植前2h給予供體他汀類藥物口服，可以有效防止心肌再灌注時微血管內皮細胞的滲透性增加和無復流現象。本研究應用活體冷凍技術(In Vivo Cryotechnique，IVCT)，觀察再灌注前2h采用阿托伐他汀預處理對缺血再灌注小鼠心肌心外膜下微血管血流狀態及滲透性的影響，探討阿托伐他汀對微血管內皮屏障的保護作用及機制。

1材料與方法

1.1　實驗動物及分組

60只清潔級昆明小鼠由中國醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(遼)2013-0001，雄性，鼠齡5-6w，體重25-30g，普通鼠飼料喂養，自由飲水。隨機分為6組：假手術組(C組)、缺血組(I組)、再灌注組(I/R組)、再灌注前2h阿托伐他汀10mg/kg灌胃組(A102組)、再灌注前2h阿托伐他汀20mg/kg灌胃組(A202組)、再灌注前2h阿托伐他汀20mg/kg灌胃+再灌注前15min L-NAME(N-硝基-L-精氨酸甲酯)15mg/kg尾靜脈注射組(AL202組)。每組均10只小鼠。

1.2　主要藥物、試劑和儀器

阿托伐他汀片(Pfizer，美國)；兔源性抗eNOS抗體(Thermo，美國)；兔源性抗Claudin-5抗體(Santa Cruz，美國)；山羊源性抗VE-Cadherin抗體(Santa Cruz，美國)；超純水系統(NW10LVF，Heal Force，香港)；小動物呼吸機(HX-100E，成都泰盟科技有限公司)；多導生理記錄儀(PowerLab15T，AD Instrument，澳大利亞)；光學顯微鏡(SMZ-168，Olympus，日本)；電子天平(PB303，METTLER TOLEDO，瑞士)；電泳儀(BIO-RAD，Model250/2.5，瑞典)；冷凍離心機(Sorvall Super T21，Thermo，美國)；超聲細胞破碎機(Dr.HIELSCHER，德國)。

1.3　小鼠心肌缺血再灌注模型的建立[5]

戊巴比妥鈉100mg/kg腹腔麻醉，氣管插管，接小動物呼吸機，四肢連接生理記錄儀，胸骨左緣第三肋間開胸，逐層分離暴露心臟，在左心耳與肺動脈圓

錐間，冠狀動脈起始點下方2-3mm處，用6-0帶針線穿線，穿線后墊一乳膠圈，結扎冠狀動脈前降支。生理記錄儀觀察到小鼠心電圖ST段抬高即可確認心肌梗死模型制備成功[6]。再灌注時連同乳膠圈一并剪開結扎線，解除阻斷血流。

1.4　各組小鼠處理方法

C組：以6-0帶針線由冠脈下穿過，不結扎；I組：結扎冠脈30min；I/R組：結扎冠脈30min，再灌注1h；A202組及A102組：再灌注前2h予阿托伐他汀20mg/kg或10mg/kg灌胃，結扎冠脈30min，再灌注1h；AL202組：再灌注前2h予阿托伐他汀20mg/kg灌胃，結扎冠脈15min(即再灌注前15min)時予L-NAME 15mg/kg尾靜脈注射，至結扎冠脈30min后再灌注1h。均以IVCT技術摘取心臟，其中5只小鼠心臟行冷凍置換、石蠟包埋，之后切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色及Albumin免疫組織化學染色；另5只小鼠心肌組織采用 Western Blotting檢測內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、黏附連接蛋白(VE-cadherin)和緊密連接蛋白-5(Claudin-5)的表達水平。

1.5　IVCT與冷凍置換

將預先在液態氮(-196℃)中預冷的異戊烷-丙烷制成的冷凍劑(-193℃)直接傾倒在小鼠跳動的心臟組織表面，然后將小鼠迅速移到液態氮中。在液態氮中分離心臟組織后將心臟移到由干冰丙酮制冷的含2%多聚甲醛的丙酮溶液中(-80℃)進行冷凍至少48h，之后分別在-30℃、-10℃、4℃和室溫下放置2h。純丙酮脫水3次，每次1h。二甲苯透明，低溫石蠟(50-52℃)溫箱(60℃)過夜，混合蠟(56-58℃石蠟與低溫石蠟按3∶1混合)孵育6h后包埋。

1.6　HE染色

將上述包埋的心臟組織切片(厚3μm)，常規去石蠟后行HE染色，于顯微鏡下觀察心肌微血管(約5μm)內紅細胞灌注情況。

1.7　心肌間質Albumin水平檢測

采用免疫組化染色法。將上述石蠟切片常規去石蠟后用0.3%過氧化氫溶液去除內源性過氧化酶活性，之后用5%魚精蛋白封閉，一抗(1∶100)4℃過夜，二抗(1∶1 000)室溫孵育1h，ABC-DAB顯色5min，0.04%鋨酸處理1min，以降低背景，增加顯色對比效果。顯微鏡下觀察，拍照。每只小鼠隨機抽取5張顯微照片(每組共25張)，觀察記錄心肌間質內Albumin染色強度，分為5級：陰性(-)，弱陽性(±)，陽性(+)，中強度陽性(2+)，強陽性(3+)。結果分別來自3名觀察者。Albumin陽性呈棕黃色。

1.8　心肌組織蛋白表達的檢測

采用Western Blotting。取-80℃凍存的各組心肌組織，參考文獻[7]方法配制細胞裂解液,提取胞漿總蛋白,按BCA蛋白含量測定試劑盒說明書進行蛋白定量,SDS-PAGE后蛋白轉印于PVDF膜,一抗孵育:分別加入兔源性抗eNOS抗體(1∶500)、抗Claudin-5抗體(1∶200)及山羊源性抗VE-Cadherin抗體(1∶100)；4℃封閉過夜,洗膜后二抗孵育:加入羊抗兔二抗,驢抗山羊二抗(1∶500)，室溫孵育1h。洗膜后于暗室中行ECL顯色。用凝膠圖像處理系統(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標條帶和β-actin條帶的光密度值，用兩者比值表示其相對表達量。

1.9　統計學處理

2結果

2.1　各組小鼠心肌血流灌注情況比較

顯微鏡下，C組可見大量具有方向性和流動狀態的降落傘樣紅細胞保存在心肌細胞間的各級血管內，心肌細胞界限清晰。I組和I/R組血管內紅細胞形態不一，或破碎，部分血管內紅細胞明顯減少或缺如，心肌細胞腫脹，界限模糊。與I/R組相比，A202組心肌細胞界限較清晰，降落傘樣紅細胞的頂端指向血流方向。A102組鏡下所見與A202組類似，但微血管內紅細胞數量、形態及心肌細胞界限等不及A202組。AL202組可見心肌細胞腫脹，微血管內紅細胞減少、缺如，存在少量破碎紅細胞，但微血管血流灌注情況仍優于I/R組。見圖1。

2.2　各組小鼠心肌血管滲透性比較

免疫組織化學染色結果顯示，C組Albumin主要分布于微血管內，間質、閏盤等處僅有少量分布。I組和I/R組微血管與心肌細胞界限模糊，結構破壞，Albumin向心肌間質滲出。與I/R組相比，A202組微血管、心肌細胞等各結構間界限清晰，Albumin主要分布于微血管內，向心肌間質等滲漏不明顯。A102組與A202組類似，但微血管、心肌細胞等各結構間界限清晰程度稍差，Albumin向心肌間質的滲漏稍多。AL202組心肌細胞腫脹，各結構間界限模糊，Albumin向心肌間質內滲漏明顯增多，但仍少于I/R組。見圖2。各組Albumin免疫組織化學染色強度的統計學比較結果見表1。

表1　各組心肌間質Albumin染色強度比較

注：與C組比較，1)P<0.05；與I組和I/R組比較，2)P<0.05

2.3　各組小鼠心肌組織eNOS、VE-cadherin、Claudin-5蛋白表達

2.3.1eNOS蛋白表達：I組和I/R組與C組比較，eNOS表達差異無統計學意義(P>0.05)，A202組和A102組與I組和I/R組比較，eNOS表達均明顯升高(P<0.01)，A202組升高更明顯(P<0.05)。AL202組與A202組比較，eNOS表達降低(P<0.05)，且與I/R組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.3.2VE-cadherin蛋白表達：與C組相比，I組和I/R組VE-cadherin蛋白表達顯著降低(P<0.05)。A102和A202組VE-cadherin蛋白表達較I組和I/R組明顯升高(P<0.05)，A202組升高更明顯(P<0.05)。AL202組VE-cadherin蛋白水平較I/R組升高(P<0.05)。見圖4。

注：與I組和I/R組比較，*P<0.01；與A102組比較，

2.3.3Claudin-5蛋白表達：與C組相比，I組和I/R組Claudin-5蛋白表達顯著降低(P<0.05)。A102和A202組Claudin-5蛋白表達較I組和I/R組明顯升高(P<0.05)，A202組升高更明顯(P<0.05)。AL202組Claudin-5表達較I/R組升高(P<0.05)。見圖5。

[本文圖1、圖2見封2]

3討論

IRI是指組織、器官供血中斷一定時間后再恢復血供時，組織器官功能障礙和結構損傷反而進一步加重的現象，是臨床亟待解決的關鍵問題之一。再灌注過程中，冠脈血管內皮屏障受損、滲透性增加是構成IRI病理生理過程的基礎，并可導致微血管受壓、血管痙攣、血栓形成等一系列病理過程[8]。本文結果顯示，I組和I/R組小鼠心肌血管內紅細胞形態紊亂、破碎，部分區域紅細胞明顯減少或缺如，血管和心肌界限明顯模糊，結構破壞，Albumin向心肌間質明顯滲出。而A102組和A202組血管內紅細胞數量較I/R明顯增加，形態較I/R組明顯改善，微血管和心肌細胞界限清晰，Albumin向間質滲漏不明顯，尤以A202組作用更顯著，表明再灌注前2h給予小鼠阿托伐他汀20mg/kg灌胃可明顯改善缺血再灌注心肌微循環的血流狀態及微血管滲透性，且效果優于10mg/kg，進一步證實了再灌注前短時間大劑量他汀類藥物強化治療的額外獲益。

注：與C組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05；

注：與C組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05；

構成血管內皮屏障的連接結構中，黏附連接主要由黏附連接蛋白Cadherin及Catenin組成，其中Cadherin的作用更為關鍵[9]。緊密連接則主要由緊密連接蛋白Occludins及Claudins等組成，既往研究報道Occludin缺失并不顯著影響緊密連接的形態及內皮屏障功能[10]，因而Claudin-5在調節緊密連接組成及血腦屏障功能中起重要作用[11]，且可能是雌激素保護心血管內皮屏障新的作用靶點[12]。而本研究結果顯示，阿托伐他汀預處理可明顯改善缺血再灌注引起的心肌微血管滲透性增加，改善內皮細胞間黏附連接蛋白VE-cadherin和緊密連接蛋白Claudin-5的表達，且該作用不可能被L-NAME所完全消除，進一步證實阿托伐他汀對缺血再灌注過程中細胞間連接蛋白的保護作用，而且該保護作用并非既往研究認為的完全通過eNOS/NO途徑實現[13]，其具體機制可能與他汀類藥物對微血管中RhoA(一種小GTP酶)/Rho激酶通路活性的抑制作用相關[14]。

傳統組織制備方法因血液組分丟失及可溶性血清蛋白移位等問題易致微環境內的人工假象，故檢測心臟IRI微血管滲透性多需通過尾靜脈注射伊文斯藍等染色劑，觀察其在心臟大體標本中的滲出來完成。本研究應用IVCT技術實現了活體狀態下于微循環水平直接評估血流狀態及微血管滲透性的變化，具備良好的可信性。

綜上，本研究證實再灌注前短時間內大劑量阿托伐他汀強化治療可明顯改善缺血再灌注心肌微循環血流狀態，降低微血管滲透性，并可增加內皮細胞間連接蛋白VE-cadherin、Claudin-5等的表達，其機制不完全依賴于eNOS/NO途徑。

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趙世杰(1982—)，男，滿族，博士，主治醫師，從事冠心病的臨床防治研究

參考文獻

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作者簡介：本文第一

*[基金項目]國家自然科學青年基金項目(81200083)；教育部重點實驗室課題(KF201312)

[中圖分類號]R541.4

[文獻標識碼]A

[文章編號]1005-1740(2015)04-0001-06

doi：10．3969／j．issn．1005－1740．2015．04．001

微循環學雜志，2015，25（4）：1－6

? 2015 CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATION