脂多糖致膿毒血癥大鼠血管內皮細胞凋亡的實驗觀察*

周　榮　丁曉莉　劉良明

脂多糖致膿毒血癥大鼠血管內皮細胞凋亡的實驗觀察*

周榮丁曉莉劉良明#

【摘要】目的：觀察細菌脂多糖(LPS)致膿毒血癥大鼠血管內皮細胞(VEC)凋亡的器官靶向性及時相性特征。方法：70只SD大鼠經尾靜脈一次性注射LPS(10mg/kg)復制膿毒血癥模型后平分為30min組、1h組、2h組、4h組、8h組、16h組和24h組。另選10只SD大鼠作為正常對照組。眼眶采血，ELISA檢測各組血清中血管性血友病因子(vWF)及炎性介質白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的變化特征。斷頭處死對照組、1h組、4h組和8h組大鼠，取肺、肝、心、腦、腎制作組織切片，采用地高辛標記凋亡細胞，免疫組化染色檢測上述各組大鼠各臟器VEC凋亡。結果：2h-24h組TNF-α濃度均較對照組升高，4h組達峰值(P<0.01)；IL-1β在2h組和4h組顯著高于對照組，2h組為峰值(P<0.01)，8h-24h組與對照組無顯著差異(P>0.05)。4h-8h組大鼠血清vWF濃度較對照組升高，4h組達峰值(P<0.05)，其它時相組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。LPS致膿毒血癥大鼠肺、肝、心、腦、腎存在不同程度VEC凋亡現象，其中肺部受累較早。結論：LPS(10mg/ml)所致膿毒血癥大鼠重要臟器可出現VEC凋亡，以肺部較早。

【關鍵詞】脂多糖；膿毒血癥；內皮細胞；凋亡；大鼠

Observation of Vascular Endothelium Cell Apoptosis in Endotoximia Rat induced by LPS

ZHOU Rong, DING Xiao-li, LIU Liang-ming#

State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, The 2ndDepartment of Research Institute of Surgery, Daping Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400042, China；#Corresponding author

【Abstract】Objective: To evaluate vascular endothelium cell (VEC) apoptosis and its characteristics in lipopolysaccharide (LPS) induced endotoxic model in rat. Method: LPS (10mg/kg) was administered in one bout via caudal vein in 70 rats and then divided randomly into LPS-administered after 30min, 1h, 2h, 4h, 8h, 16h, and 24h group. Another 10 rats was adopted as control group. Blood was collected from orbit. The concentrations of von Willebrand factor (vWF) and interleukin 1β (IL-1β) and tumor necrosis factor α (TNF-α) were detected by ELISA. Rats were sacrificed by decaptitation. The tissue of heart, liver, brain, kidney, lung were collected and made tissue slice. VEC apoptosis of these organs was evaluated with immunohistochemisty staining labeled with digoxin dUTP after LPS was administered. Results: The concentration of TNF-α in serum increased in LPS- administered 2h-24h group compared with the control group, and peaked at 4h group (P<0.01). The concentration of IL-1β in serum also increased in LPS- administered 2h-4h group, peaked at 2h group (P<0.01), and there were no significant difference between 8h-24h and control group respectivly (P>0.05).The concentration of vWF in serum enhanced gradually after LPS in LPS-administered 2h-8h group, peaked at 4h group (P<0.05), decreased in 16h and 24h group compared with 4h group (P<0.05). The apoptosis of VEC from vital organ (lung, heart, brain, kidney and

[作者單位]第三軍醫大學第三附屬醫院野戰外科研究所第二研究室，創傷、燒傷及復合傷國家重點實驗室，重慶 400042；#通訊作者,Tel：023-68757421；E-mail：liuliangming@yahoo.com

本文2015-07-09收到，2015-09-06修回

liver) occurred after LPS administered for 2-4h, and lung was the most early organ involved. Conclusion: VEC apoptosis occurred in LPS (10mg/ml) induced endotoximia in rat, and lung is the much earlier organ involved.

【Key words】Lipopolysaccharide (LPS)； Endotoximia；Vascular endothelial cell (VEC)；Apoptosis；Rat

血管內皮細胞(Vascular Endothelial Cell, VEC)是各種傷害性刺激(如組織缺血/再灌注、感染等)最先侵犯的部位，是介導膿毒癥/膿毒性休克等臨床重癥發生發展的關鍵細胞之一[1]。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)作為革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，可激活機體炎癥反應。LPS通過Toll樣受體4/2 (TLR4/2)介導的信號轉導系統，促進核轉錄因子-κB(Nuclear Transcriptional Factor-κB，NF-κB)的核移位及炎性介質白介素-1β(Interleukin 1β， IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)等的合成、釋放，由一系列信號傳導過程引起機體循環血中炎性細胞(如中性粒細胞)及VEC的激活，誘導細胞凋亡的發生[2,3]。VEC凋亡是膿毒血癥的一個重要病理環節。動物實驗表明，血管內注射內毒素能引起微血管內皮損害和VEC脫落[4]；臨床膿毒血癥患者外周血中不但可檢測到脫落的內皮細胞，且其增加程度與患者死亡率密切相關[5]。這些資料表明，膿毒血癥時VEC凋亡和脫落可能與膿毒癥所致微血管滲漏、組織水腫及器官功能衰竭的發生密切相關，其在膿毒癥的發展演變中起著重要作用。本研究經大鼠尾靜脈注射LPS致膿毒血癥模型，觀察制模后不同時間實驗大鼠外周循環血中炎性介質指標(TNF-α、IL-1β)和血管性血友病因子(von Willebrand Factor，vWF)水平的變化及不同臟器(肺、肝、心、腦、腎)組織中VEC凋亡現象，初步評價經靜脈注射LPS致大鼠膿毒血癥時VEC凋亡的發生規律。

1材料與方法

1.1　實驗動物和試劑

1.1.1實驗動物： 清潔級SD大鼠80只(200-220g)，雌雄不限，由第三軍醫大學第三附屬醫院野戰外科研究所實驗動物中心提供(動物合格證號：SYXK2002-032)。

1.1.2實驗主要試劑：LPS(O111∶B4)購自美國Sigma公司(批號：114M4009V)，實驗時用生理鹽水溶解。細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司(批號：MK1023)，大鼠TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司(批號：002859、028514)；大鼠vWF ELISA試劑盒購自上海博谷生物科技有限公司(批號：REV002)；其它試劑均為國產分析純。

1.2　復制大鼠膿毒血癥模型及分組處理

取70只SD大鼠，實驗前禁食1h，自由進水。實驗當日經尾靜脈一次性注射LPS(10mg/kg)復制大鼠膿毒血癥模型[6]，隨機平分為LPS 0.5h、1h、2h、4h、8h、16h和24h組。另取10只大鼠經尾靜脈注射相同體積滅菌生理鹽水(對照組)。

1.3　樣本采集

各組大鼠經眼眶取血1ml后，頸椎脫臼處死，迅速摘取對照組、1h組、4h組和8h組大鼠心、肝、肺、腦及腎組織。為避免灌注可能帶來的血管內皮損傷，以上臟器均不進行灌注沖洗。所有臟器均快速取出并放入預冷生理鹽水中。心臟組織選取左心室，沿最大縱斷面取材；肝臟選肝右葉縱斷面取材；肺臟選取左肺縱斷面取材；腦組織選左側大腦，縱斷面取材；腎臟選右腎，縱斷面取材。制成組織塊(厚約2mm)。組織塊在冰浴中清洗后，置4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片(5μm)。

1.4　ELISA檢測TNF-α、IL-1β及vWF濃度

各組大鼠眼眶取血離心后收集血清，嚴格按照各指標試劑盒說明書進行操作。

1.5　原位末端標記法(TUNEL)檢測血管內皮凋亡細胞

取制備好的各組各臟器組織病理切片，采用生物素標記的地高辛抗體聯合鏈酶親和素-熒光素FITC標記DNA斷裂片段的3’-OH末端，檢測凋亡VEC。操作按試劑盒說明書進行，用 PBS 緩沖液代替一抗作陰性對照，熒光顯微鏡下凋亡VEC呈黃綠色熒光顆粒。

1.6　統計學處理

2結果

2.1　各組大鼠TNF-α和 IL-1β血清水平變化

各組TNF-α和 IL-1β水平差異有統計學意義(F=6.372、6.138，P<0.01)。與對照組比較，2h-24h組大鼠血清TNF-α水平顯著升高，4h組為峰值(t均>2.074，P<0.01)，見圖1。2h組、4h組大鼠IL-1β濃度較對照組顯著升高，2h組為峰值(t均>2.283,P<0.01)；8h-24h組與對照組比較無顯著性差異(t均<1.136，P>0.05)。見圖2。

注：與對照組比較，*P<0.01

注：與對照組比較，*P<0.01

2.2　各組大鼠血清vWF水平變化

各組大鼠血清vWF水平差異有統計學意義(F=6.439，P<0.05)。與對照組比較，4h組和8h組vWF濃度升高(t值分別為2.173和1.969，P<0.05)，4h組達峰值。0.5h組、1h組、2h組、16h組和24h組與對照組差異無統計學意義(t均<1.098，P>0.05)。見圖3。

注：與對照組比較，*P<0.05

2.3　各組大鼠各臟器VEC凋亡情況

圖4顯示，對照組各臟器均未見凋亡VEC。1h、4h和8h組大鼠左肺組織肺泡壁VEC均見黃綠色熒光顆粒，并隨著時間延長，肺泡壁增厚，間質水腫，炎性細胞浸潤；4h和8h組大鼠右肝組織VEC亦呈黃綠色熒光染色，但肝血竇間隙未見增加，無明顯組織水腫；8h組大鼠左心肌組織可見VEC凋亡，且心肌細胞間隙增加，炎性細胞浸潤；4h和8h組大鼠左腦組織間隙增加，可見VEC凋亡；8h組大鼠右腎組織腫脹，組織間隙增加及水腫，亦見凋亡VEC。

[本文圖4見插2]

3討論

LPS是革蘭陰性細菌胞壁中的一種成分，是導致嚴重創傷后全身炎性反應綜合癥、器官功能衰竭發生及機體死亡的常見原因[7]。VEC作為覆蓋在循環系統內部的單層細胞，在血管舒縮功能的調節、營養物質的轉運、血液流動性的維持及臟器組織血供的保障中發揮重要作用。膿毒血癥時，VEC凋亡可引起血管舒縮功能失調、組織水腫及組織供血不足等多種并發癥的發生。

目前采用的大鼠膿毒血癥模型通常是盲腸結扎穿孔。本實驗采用大鼠經尾靜脈一次性注射LPS(10mg/kg)所致膿毒血癥，觀察其對重要臟器VEC凋亡的影響。結果顯示，LPS注射2h后，大鼠血清炎性因子 TNF-α和IL-1β水平較對照組升高，提示LPS(10mg/kg)經尾靜脈注射可誘導大鼠膿毒血癥發生，其中TNF-α升高時間持續更長，可以作為提示膿毒癥發生較敏感的指標。

基礎研究表明，膿毒血癥患者血清vWF濃度升高[8]，且與VEC功能異常及患者預后關系密切[9]；急性肺損傷患者早期血清vWF濃度升高，且與病死率成正比[10，11]。本實驗結果表明，與對照組比較，LPS注射后4-8h，大鼠血清vWF顯著升高，16-24h降低至對照組水平；各組大鼠肺、心、肝、腎、腦組織的VEC均在不同時相發生不同程度凋亡(呈黃綠色熒光顆粒)，且多數器官出現相應的細胞或組織間隙腫脹。其中肺是較早受累的器官。

綜上，經尾靜脈注射LPS可誘導大鼠膿毒血癥及VEC凋亡，引起血管內皮通透性增加和組織水腫。提示在膿毒血癥早期干預VEC凋亡的發生，對防治嚴重創傷后血管滲漏、組織水腫及器官功能衰竭有重要意義。

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周榮(1971-)，女，漢族，醫學博士，副研究員，研究方向為休克血管功能障礙發生機制及防治

參考文獻

1Opal SM, van der Poll T. Endothelial barrier dysfunction in septic shock[J]. J Intern Med, 2015, 277(3): 277-293.

2Triggle CR, Samuel SM, Ravishankar S, et al. The endothelium: influencing vascular smooth in many ways[J]. Can J Physio Pharmacol,2012,90(6):713-738.

3Zhao QT, Guo QM, Wang P, et al. Salvianic acid A inhibits lipopolysaccharide-induced apoptosis through regulating glutathione peroxidase activity and malondialdehyde level in vascular endothelial cells[J]. Chin J Nat Med,2012,10(1):53-57.

4Cybulsky MI, Chan MK, Movat HZ. Acute inflammation and microthrombosis induced by endotoxin, interleukin-1, and tumor or necrosis factor and their implication in gramnegative infection[J]. Lab Invest,1988,58(4):365-378.

5Mutunga M, Fulton Bullock R. Circulating endothelial cell in patients with septic shock[J]. Am J espir Crit Care Med,2001,163(1):195-200.

6Bannerman DD, Goldblum SE. Mechanisms of bacterial lipopolysaccharide-induced endothelial apoptosis[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2003,284(6):L899-L914.

7Brott DA, Katein A, Thomas H, et al. Evaluation of von Willebrand factor and von Willebrand factor propeptide in models of vascular endothelial cell activation, perturbation, and/or injury[J]. Toxicol Pathol, 2014,42(4):672-683.

8姜福富，覃鋼，韋柳青，等.連續性靜脈血液濾過對膿素癥患者內皮功能的作用[J].實用臨床醫學雜志，2011，15(23)：21-23.

9Blann AD. Plasma von Willebrand factor, thrombosis, and the endothelium: the first 30 years[J]. Thromb Haemost, 2006,95(1):49-55.

10Martin K, Borgel D, Lerolle N, et al. Decreased ADAMTS-13 (A disintegerin-like and metalloprotease with thrombospondin typr 1 repeats) is associated with a poor prognosis in sepsis- induced organ failure[J]. Crit Care Med, 2007,35(10):2 375-2 382.

11Flori HR, Ware LB, Milet M, et al. Early elevation of plasma von Willebrand factor antigen in pediatric acute lung injury is associated with an increased risk of death and prolonged mechanical ventilation[J]. Pediatr Crit Care Med,2007,8(2):96-101.

作者簡介：本文第一

*[基金項目]重慶市自然科學基金重點項目資助課題(CSTC2009BA5018)

[中圖分類號]R363.1+4

[文獻標識碼]A

[文章編號]1005-1740(2015)04-0007-04

doi：10．3969／j．issn．1005－1740．2015．04．002

微循環學雜志，2015，25（4）：7－10

? 2015 CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATION