鹽酸克倫特羅對人類誘導多能干細胞來源心肌細胞的毒性作用

楊　慧　吳劭一　毛益申　王青潔　劉　琛　周　奕　孫　寧,*

sunning@fudan.edu.cn

鹽酸克倫特羅對人類誘導多能干細胞來源心肌細胞的毒性作用

楊慧1吳劭一2毛益申1王青潔1劉琛3周奕2孫寧1,*

sunning@fudan.edu.cn

【摘要】目的：探討鹽酸克倫特羅對人類誘導多能干細胞(iPSC)來源心肌細胞的毒性作用。方法：將人皮膚來源的iPSC成功定向分化為心肌細胞，加入不同濃度鹽酸克倫特羅，使之分為對照組(0μg/ml)、1μg/ml組、 10μg/ml組、20μg/ml組、50μg/ml組、100μg/ml組等6組(n均=3)，相同條件共培養7天后，觀察鹽酸克倫特羅對心肌細胞形態大小、搏動頻率及凋亡率的影響 。結果：不同濃度鹽酸克倫特羅均可使心肌細胞縮小(P<0.05)，50-100μg/ml鹽酸克倫特羅可致心肌細胞骨架斷裂，甚至呈顆粒狀。各種濃度鹽酸克倫特羅均致心肌細胞搏動頻率加快(P<0.05)，且有濃度越高搏動越快的趨勢。10μg/ml組和50μg/ml組所致心肌細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)。 結論：鹽酸克倫特羅對人類皮膚來源iPSC分化的心肌細胞有毒性作用。

【關鍵詞】鹽酸克倫特羅；誘導多能干細胞；心肌細胞；凋亡

Myotoxic Effects of Clenbuterol on Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

YANG Hui1，WU Shao-yi2，MAO Yi-shen1，Wang Qing-jie1，LIU Chen3，ZHOU Yi2，SUN Ning1,*

1Department of Physiology and Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences, Research Center on Aging and Medicine, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China；2Shanghai Middle School, Shanghai,200231；3Department of Cardiac Surgery, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China;*Corresponding author

【Abstract】Objective: To investigate the toxic effects of clenbuterol hydrochloride (CL) on cardiomyocytes (CMs) derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Method: Pluripotent stem cells derived from human skin fibroblasts were directly differentiated into CMs. The iPSC-derived CMs (iPSC-CMs) were then randomly divided into 6 groups and treated with different concentrations of CL. The cellular structure, beating frequency and apoptosis rates of these iPSC-CMs were evaluated in groups.Results: After CL treatment, iPSC-CMs morphologically exhibited a smaller size. Under 50-100μg/ml of CL, myofibers of the iPSC-CMs seemed irregular and exhibited a granular morphology. The beating frequency of iPSC-CMs and CL concentration were positively correlated. Compared with the control, the apoptosis rates in iPSC-CMs treated with 10μg/ml and group 50μg/ml were significantly increased.Conclusion: CL has toxic effects on human cardiomyocytes derived from hiPSCs.

【Key words】Clenbuterol; iPSCs; Cardiomyocytes; Apoptosis

鹽酸克倫特羅，一種人工合成的β2腎上腺素受體激動劑，為白色或類白色結晶粉末，化學性質較穩定，易溶于水、乙醇，微溶于丙酮，難溶于乙醚[1]，是“瘦肉精”的主要代表藥物，既能加速脂肪的分解，又能減少脂肪的合成，實現動物營養再分配，從而提高胴體瘦肉率和加快動物生長[2]。但若過量攝食，可引起中毒癥狀，如血壓升高、血管擴張、心率加快、呼吸加快、體溫上升、心臟和腎臟負擔加重等，并出現

行為動作失調、神經緊張甚至全身震顫[3]。已有動物實驗表明鹽酸克倫特羅可導致大鼠肝實質細胞自噬[4]、家兔心肌細胞肥大、壞死和凋亡[5]。但對人類組織細胞，包括心肌細胞的毒性研究尚未見報道，原因與人類組織細胞難以獲取有關。隨著人類誘導多能干細胞(iPSC)及定向分化技術的發展，人類組織細胞來源及其相關研究成為可能。本文用人類皮膚細胞來源iPSC定向分化為心肌細胞，并觀察不同濃度鹽酸克倫特羅對人類iPSC-心肌細胞形態、結構和功能的影響，為"瘦肉精"對人類心肌細胞的毒性作用提供理論依據。

1材料與方法

1.1　試劑和儀器

1.1.1實驗試劑：鹽酸克倫特羅(Sigma,C5423,德國)白色粉末，實驗時用去離子水溶解，配制成10μg/ml后，200μm的過濾網過濾除菌。Annexin Ⅴ 凋亡試劑盒(東仁化學有限公司，AD10，中國)；堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(Milipore，ca92590，美國)；肌鈣蛋白(Abcam，ab45932，美國)；肌小節蛋白(Abcam, ab18061，美國)；階段特異性胚胎表面抗原4 (SSEA4，Abcam,ab16287,美國)；八聚體結合轉錄因子4 (Oct4，Abcam，ab18976，美國)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Abcam，ab104140，美國)；山羊抗小鼠IgG二抗，iFluor 488熒光標記(AAT Bioquest，AAT-16448，美國)；山羊抗兔IgG二抗，iFluor 594熒光標記(AAT Bioquest，AAT-16628，美國)；DMEM培養液(Corning，美國)；RPMI 1640培養液(Corning，美國)；mTesR1(Stemcell Technology Inc，加拿大)；CHIR99021 (無錫金譜，IWN1011，中國)；IWR-1(無錫金譜，IWN1007，中國)；B27(Life technologies，A1895601，美國)。

1.1.2 實驗儀器：多電極微陣列(Multichannel Systems, m200，德國)；熒光顯微鏡(Leica，DMI3000B，德國)；流式細胞儀(BD FACS Calibur, EPICS?ALTRATM，美國)

1.2　實驗方法

1.2.1人類iPSC制備：(1)供體為中國男性(24歲)，取其皮膚，參照文獻方法，采用CytoTune?-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit(Life technology，美國)對成纖維細胞進行重編程為iPSC細胞系(iPSC-SF1)。(2)iPSC ALP檢測：將iPSC-SF1接種于鋪有matrigel的6孔板中，加2ml mTesR1培養液于37℃培養箱(含21% CO2和5% O2)中培養，待密度達50%左右時，用4%多聚甲醛固定1min，按ALP檢測試劑盒提供的方法進行染色和結果判斷。(3)iPSC干性標志蛋白檢測：將iPSC-SF1接種于鋪有matrigel及蓋玻片的12孔板中，用mTesR1培養液培養，待密度達50%左右時，用4%多聚甲醛固定，分別加入一抗(1∶150)和SSEA4(1∶200)，山羊抗小鼠IgG二抗(iFluor 488熒光標記,1∶200)和山羊抗兔IgG二抗(iFluor 594熒光標記,1∶200)。用含DAPI的封片劑封片，并于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2iPSC向心肌細胞定向分化：將人iPSC接種于鋪有matrigel的6孔板中，用mTesR1培養液培養，至密度達80%-90%時，將培養液換成含2% B27的RPMI 1640，并加12μm CHIR 99021作用48h后，再換成5μm IWR-1 作用48h，之后一直使用含2% B27的RPMI 1640培養，直到顯微鏡下觀察到細胞跳動為止。

1.2.3心肌細胞分組培養和處理：取上述心肌細胞，用膠原酶Ⅰ及0.05%胰酶消化成單細胞，接種在鋪有蓋玻片的12孔板中，每孔約1×105個細胞，每孔加入1ml含10%FBS DMEM培養液，共18孔，隨機分為6組，每組3個復孔，并分別加10μg/ml鹽酸克倫特羅應用液0μl(對照組)、0.1μl(1μg/ml組)、1μl(10μg/ml組)、2μl(20μg/ml組)、5μl(50μg/ml組)、10μl(100μg/ml組)，隔天換液,于37℃培養箱中共培養7天，進行以下實驗。

1.2.4肌鈣蛋白和肌小節蛋白檢測：取上述培養7天的心肌細胞，用4%多聚甲醛固定，分別以1∶150、1∶200的濃度染一抗(肌鈣蛋白cTnT，肌小節蛋白α-Actinin)和二抗，用含DAPI的封片劑封片，熒光顯微鏡觀察,并通過肌小節蛋白染色，應用ImageJ軟件分析統計心肌細胞形態和大小變化。

1.2.5心肌細胞搏動頻率檢測：取上述各組心肌細胞接種于多電極微陣列芯片中，每孔約1×104個細胞，加10%FBS 的DMEM培養液于37℃培養箱中培養48h后，按多電極微陣列檢測儀提供的方法分別檢測各組心肌細胞搏動頻率。

1.2.6心肌細胞凋亡率檢測：選取上述對照組、10μg/ml組(低濃度組)、50μg/ml組(高濃度組)iPSC-心肌細胞接種于6孔板中，每孔約5×105個細胞，培養12h后，按Annexin Ⅴ 凋亡試劑盒提供的方法處理細胞，并于1h內上流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率。

1.3　統計學處理

2結果

2.1　人類iPSC鑒定

人皮膚成纖維細胞來源的iPSC-SF1細胞系克隆在mTesR1培養液中呈圓形或多邊形，細胞連接緊密，單層生長，核質比高(圖1A)，ALP染色陽性(圖1B)，Oct4與SSEA4染色呈陽性(圖1C-F)，說明該iPSC細胞系干性保持完好，具有向下游分化的潛能[6, 7]。

2.2　人類iPSC定向分化的心肌細胞鑒定

采用單層2D分化方法定向分化的心肌細胞呈堆積生長趨勢(圖1G)，顯微鏡下觀察到自主收縮活動, iPSC-心肌細胞的標志蛋白肌小節蛋白a-Actinin與肌鈣蛋白cTnT染色均為陽性(圖2對照組)，符合心肌細胞特征[8, 9]。

2.3　不同濃度鹽酸克倫特羅對心肌細胞大小和形態的影響

對照組iPSC-心肌細胞呈圓形、橢圓形或多邊形，細胞貼壁良好，生長正常。在不同濃度鹽酸克倫特羅作用下培養7天，10μg/ml組-100μg/ml組細胞較對照組縮小，差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。50μg/ml組和100μg/ml組心肌細胞嚴重受損，肌小節蛋白a-Actinin染色顯示心肌纖維骨架斷裂，呈顆粒狀。見表1及圖2。

表1　不同濃度鹽酸克倫特羅對心肌細胞大小和搏動頻率

注：與對照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01

2.4　不同濃度鹽酸克倫特羅對心肌細胞搏動頻率的影響

對照組中，iPSC-心肌細胞的博動頻率約60次/min,與人類正常心肌搏動頻率相近。不同濃度鹽酸克倫特羅作用后，各組iPSC-心肌細胞搏動頻率迅速加快，最高達105次/min，均與對照組有統計學差異(P<0.05)。而且表現出隨著鹽酸克倫特羅濃度增加，細胞博動頻率明顯加快的趨勢。見表1。

圖3　心肌細胞凋亡檢測的流式細胞圖

2.5　不同濃度鹽酸克倫特羅對心肌細胞凋亡率的影響

10μg/ml組和50μg/ml組iPSC-心肌細胞凋亡率均明顯高于對照組，差異有統計學意義(t值分別為4.57、10.27，P<0.01)。見表2和圖3。

表2　不同濃度鹽酸克倫特羅對心肌細胞

注：與對照組比較，1)P<0.01

[本文圖1、圖2見插3和插4]

3討論

本文結果表明，各種濃度鹽酸克倫特羅均可使心肌細胞縮小，高濃度鹽酸克倫特羅(50μg/ml-100μg/ml)可導致心肌纖維骨架斷裂，這種形態結構變化可能是鹽酸克倫特羅通過下調基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)信號通路活性，使細胞外基質中膠原蛋白變性、降解所致[10]。

已有報道，鹽酸克倫特羅作為β2-腎上腺素受體激動劑，能夠提高大鼠心肌細胞內質網內鈣離子(Ca2+)濃度，引起鈣瞬變，使心肌肌漿網Ca2+-ATP酶2(SERCA2a)和Na+/Ca2+交換體過表達，刺激心肌細胞收縮[11],并使心肌重鏈亞型由慢性I型向快性II型轉變[12]，從而引起心肌細胞搏動頻率增加。本研究觀察到了與此相一致的現象，且發現心肌細胞搏動頻率隨鹽酸克倫特羅濃度升高而加快，表明鹽酸克倫特羅對心肌細胞有正性頻率作用。但Siedlecka等[13]采用高劑量鹽酸克倫特羅(800μg/ml)作用于家兔心肌細胞，結果顯示其能激活家兔心肌細胞Gi蛋白，降低cAMP活性，減少鈣瞬變及L型鈣電流，從而減緩心肌細胞收縮，降低心肌細胞搏動頻率。上述結果提示不同劑量鹽酸克倫特羅對不同作用對象的心肌細胞搏動頻率的影響存在差異，這種差異的原因和作用機制還需要進一步探討。

鹽酸克倫特羅主要是通過激活細胞表面磷脂酰絲氨酸激酶Caspase3來提高心肌細胞DNA的熱敏感性，從而使雙鏈變性斷裂，導致心肌細胞凋亡，在Burniston等[14]的實驗中，鹽酸克倫特羅引起家兔心肌細胞凋亡的最低濃度為1mg/kg,即1ng/ml作用2h，細胞即開始凋亡。本文采用10μg/ml鹽酸克倫特羅干預12h后，心肌細胞凋亡率達14.80%，50μg/ml達24.6%，表明一定濃度鹽酸克倫特羅有誘導人類iPSC-心肌細胞凋亡的作用。

綜上所述，鹽酸克倫特羅對人類iPSC-心肌細胞有一定毒性作用。盡管目前未能了解一般人群體內殘留的瘦肉精含量及其對人體的危害程度，但瘦肉精對心血管系統的損害，應該引起全社會的重視和廣大科研工作者的深入研究，共同保障國人食品安全。

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楊慧(1990-)，女，漢族，碩士研究生，研究方向：iPSC與心肌組織工程

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作者簡介：本文第一

[中圖分類號]R337

[文獻標識碼]A

[文章編號]1005-1740(2015)04-0015-05

doi：10．3969／j．issn．1005－1740．2015．04．005

本文2015-05-04收到，2015-09-02修回

微循環學雜志，2015，25（4）：15－18，24

? 2015 CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATION