過表達microRNA-21對大鼠心肌梗死面積的影響

張小花　方五旺　管麗娟　王　斐　王騰飛

過表達microRNA-21對大鼠心肌梗死面積的影響

張小花1方五旺2管麗娟3王斐3王騰飛3

【摘要】目的：觀察直接心肌注入microRNA-21基因腺病毒對大鼠心肌梗死面積的影響。方法：40只健康SD大鼠，隨機分為五組：假手術組、模型組、生理鹽水組、腺病毒載體組、microRNA-21腺病毒組，每組8只。假手術組只開胸、穿線，不結扎，也不注射任何物質。余4組通過結扎冠狀動脈左前降支復制心肌梗死模型，其中模型組成模后不做其它處理，另3組成模后分別注入不同目標物質。飼養3天后一并處死，摘取心臟，采用實時熒光定量PCR檢測左心室心肌microRNA-21表達量，采用TTC染色法測量心肌梗死面積。統計學分析各組上述指標間的差異。結果：microRNA-21腺病毒組microRNA-21表達量(0.72±0.01)較其它四組明顯增加(P<0.01)，其它四組間差異無統計學意義(P>0.05)；假手術組未見心肌梗死，microRNA-21腺病毒組心肌梗死面積(31.27±1.60%)較其它三組明顯減小(P<0.05)，其它三組心肌梗死面積差異均無統計學意義(P>0.05)。結論：直接心肌注射microRNA-21基因腺病毒可實現心肌microRNA-21基因的過表達，進而減小心肌梗死面積。

【關鍵詞】microRNA-21基因；過表達；心肌梗死；大鼠

Relationship between Myocardial Infarction Size and the Overexpression of Micro RNA-21

ZHANG Xiao-hua1,FANG Wu-wang2,GUAN Li-juan3,WANG fei3,WANG Teng-fei3

1Department of Cardiology,3Department of Geriatric, The Fifth People's Hospital of Chengdu City,Chendu 611130,China;2Department of Cardiology, The Second People's Hospital of Wuhu in Anhui Province,Wuhu 241000,China

【Abstract】Objective: To investigate the effects on myocardial infarction(MI) size through injecting gene adenovirus carrying micro RNA-21 (miR-21) into the myocardium directly. Method: Forty male mice were divided into sham group, model group, saline group, adenovirus vector group,miR-21 adenovirus group. The sham group was only opened and threaded without ligation and infusion. The remaining four groups were subjected to MI by left anterior descending artery (LAD) ligation, model group was left untreated,while the other three groups were infused different target materials into surrounding areas of MI after building model successfully. Then executed the mice and spayed the heart at 3th day concurrent. Expression of miR-21 in surrounding areas of left ventricular MI was detected with real-time PCR and MI size was measured with TTC dyeing. Results: The expression of micrornas-21 of injection with microras-21 adenovirus vector group (0.72±0.01) was significantly increased than the other four groups(P<0.01).There was no obvious differences among the other four groups; sham group had no myocardial infarction， while myocardial infarction size of micrornas-21 adenovirus vector group (31.27±1.60%) significantly decreased than the other three groups (P<0.05).There were no significant statistical differences among them. Conclusion: Intramyocardial injections by directly injection with miR-21 gene adenovirus vectors can realize overexpression of miR-21 gene, the gene expression of miR-21 in three days after myocardial infarction has the effect that reduce MI size.

【Key words】MicroRNA-21; Overexpression; Myocardial infarction; Mice

[作者單位]四川省成都市第五人民醫院，成都 611130；1心內科；3老年病科；2安徽省蕪湖市第二人民醫院心內科，蕪湖 241000

本文2015-07-20收到，2015-09-30修回

心肌梗死是指心肌缺血超過一定時間，心肌血液灌注量和需求量失去平衡，心肌細胞失去營養支持所致的心肌細胞壞死。傳統的治療方法主要包括藥物溶栓、經皮冠狀動脈支架介入(Percutaneous Coronary Intervention，PCI)以及冠狀動脈旁路移植術(Coronary Artery Bypass Grafting，CABG)。但部分終末期患者并不適宜上述治療，需尋求新的治療方案。近年來，微小RNA(microRNA)已受到臨床關注和應用研究。

MicroRNA是真核生物中的一種非編碼單鏈小分子RNA，參與眾多疾病的病理生理過程，如各種細胞之間的信號轉導、細胞增殖和死亡、肌細胞收縮和舒張、神經元形成、心血管病變和病毒感染后的調節等[1]。載入或剔除相關microRNA基因可緩解或加重疾病進展[2]，或可作為循環標志物被用來檢測心肌損傷[3]。而microRNA-21則是影響心肌梗死面積的重要調控基因，在多種類型心臟應激后表達增加[4]，是目前microRNA的研究熱點。本文通過直接心肌注入攜帶microRNA-21基因的腺病毒至心肌梗死大鼠，觀察過表達microRNA-21對原有心肌梗死面積的影響，為心肌梗死的基因治療提供實驗依據。

1材料與方法

1.1　實驗試劑和器材

25%烏拉坦(皖南醫學院藥劑科)，TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑，上海漢恒生物研究所)，cDNA合成試劑盒(加拿大Fermentas公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，PCR擴增引物及SYBR Green PCR試劑盒(海捷瑞生物工程公司)，腺病毒載體Ad-miR21及空基因腺病毒載體(上海漢恒生物公司)，7-0縫線(上海浦東金環醫療用品有限公司)，4℃冰箱(青島海爾公司)，微量注射器(大龍醫療設備上海有限公司)，HX-300動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)，Powerlab/4ST型心電圖機、AB104-N電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司生產)，體視顯微鏡(Olympus公司)等。

1.2　實驗動物及分組處理

1.2.1動物及分組： 健康雄性SD大鼠40只，體重250±30g，購自安徽省合肥實驗動物中心。隨機分為5組：假手術組、模型組、生理鹽水組、腺病毒載體組、microRNA-21腺病毒組，每組8只。

1.2.2心肌梗死模型的建立[5]：大鼠以25%烏拉坦(0.4ml/100g)腹腔注射麻醉后固定于鼠臺，分離氣管后行氣管插管，連接動物呼吸機(呼吸頻率50-60次/min，潮氣量4-6ml/次)和心電圖機(記錄標準導聯心電圖)。開胸，常規暴露心臟及左室表面血管，以左冠狀動脈主干為標志，于肺動脈圓錐與左心耳之間距主動脈根部約3-4mm處進針(深度2mm左右)，置放無創縫合線(7-0)，假手術組不行結扎，余4組進行縫扎。結扎后各組結扎區心肌活動幅度減弱或消失、心肌顏色較相鄰區域變淺或變白(圖1)，心電圖各導聯ST段抬高>0.2mv，持續30min為急性心肌梗死建模成功[5]，4組大鼠均成模。

1.2.3各組干預方法：假手術組及模型組大鼠均不予任何干預。生理鹽水組、腺病毒載體組及microRNA-21腺病毒組用微量注射器分別吸取100μl生理鹽水、腺病毒載體溶液、攜帶microRNA-21腺病毒溶液，按照圖1標注的干預注射點直接注入梗死心肌周圍。然后逐層縫合手術切口，關胸，拔除氣管插管，腹腔注射青霉素防止術后感染。

1.3　檢查指標和方法

術后，各組大鼠飼養3天，為方便比較，每組隨機選取5只大鼠行以下指標檢測(術后假手術組、模型組、生理鹽水組、腺病毒載體組、microRNA-21腺病毒組大鼠分別存活8、6、5、6、7只)，采用前述麻醉和手術方法摘取心臟，用生理鹽水沖洗表面血液后，于-80℃冰箱凍存。

1.3.1microRNA-21檢測：取出冰凍心肌組織0.1g，采用實時熒光定量PCR檢測心肌microRNA-21的表達量，反應體系為25μl，循環模式：94℃ 預變性2min，94℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 30s，40個循環，72℃ 10min,10℃ 20min，以U6作參照基因。采用相對定量法中的2-△△Ct方法分析各組microRNA基因相對表達量。

1.3.2TTC染色：按照以下步驟配制新鮮TTC溶液：將1L 0.1M Na2HPO4溶液與0.5L 0.1M NaH2PO4溶液混合，調整pH值為7.4,取混合液100ml，將1g TTC粉劑溶于其中即得1%新鮮TTC溶液。取出冰凍心臟，做垂直左心室長軸連續切片，厚1-1.5mm。將心肌組織切片置于1%TTC液中，于37℃水浴15min，然后置于10%福爾馬林固定10min后于體視顯微鏡下觀察，拍照。用Image Pro Plus 6.0軟件分析照片，量化心肌梗死面積，以纖維組織區域(蒼白區的心肌)占整個切片(蒼白區加上染色的心肌)的百分比表示。

1.4　統計學處理

2結果

2.1　各組microRNA-21表達量比較

各組microRNA-21表達差異有統計學意義(F=2.649，P<0.05)。模型組、生理鹽水組、腺病毒載體組與假手術組間差異均無統計學意義(P>0.05),而microRNA-21腺病毒組microRNA-21表達水平顯著高于其它四組(t值分別為3.714、3.513、3.368、3.472，P<0.01)。見表1。

表1　各組microRNA-21基因相對表達量和心肌梗死

注：與假手術組比較，1)P<0.01；與模型組、生理鹽水組、腺病毒載體組比較，2)P<0.05,3)P<0.01

2.2　各組心肌梗死面積比較

假手術組心肌組織為磚紅色，未見心肌梗死，余四組均可見到有明顯心肌梗死(蒼白區)，microRNA-21腺病毒組梗死面積較小，見圖2。定量分析顯示，四組心肌梗死面積差異有統計學意義(F=5.063，P<0.01)。microRNA-21腺病毒組心肌梗死面積小于模型組、生理鹽水組和腺病毒載體組(t值分別為2.371、2.614、2.601，P<0.05)。模型組、生理鹽水組和腺病毒載體組三組間心肌梗死面積差異無統計學意義(F=2.239,P>0.05)。見表1。

[本文圖1、圖2見封3]

3討論

本實驗采用經典心肌梗死模型，制作時將結扎部位選擇在主動脈圓錐和左心耳交界處往下3-4mm，提高了大鼠成模率和存活率，同時選取腺病毒載體攜帶microRNA-21直接心肌注射，不僅具有良好的安全性，較高的轉染效率，相對長的表達時間，而且操作便捷，充分保障了實驗的科學性和時效性。結果表明microRNA-21腺病毒組注入3天后，其心肌組織microRNA-21表達水平顯著升高，心肌梗死面積明顯小于模型組、生理鹽水組和腺病毒載體組。提示心肌過表達microRNA-21可對心肌梗死起保護作用。

治療心肌梗死目前常選擇溶栓和冠脈介入來開通血流以拯救壞死心肌和提高心臟功能[6，7]。探討基因治療也是基礎和臨床研究的熱點。microRNA-21與心血管疾病密切相關，已被很多研究，包括本實驗證實其在心肌梗死早期的病理過程中起到調節作用，因此可能是治療心肌梗死的新靶點[8]。

但microRNA-21減少心肌梗死的作用機制尚不明確。有研究[9]證實，過表達microRNA-21可以減少梗死心肌周圍的膠原沉積，并可通過調節腫瘤壞死因子-α(TNF-α)減少心肌細胞凋亡，提高心臟功能。更重要的是，過表達microRNA-21還可通過調節轉化生長因子-β(TGF-β)受體II來極大地激活纖維母細胞增殖和分化，通過一系列機制促進心臟結構和功能的重塑，促進梗死后心肌組織的修復，有效防止心臟破裂[10-12]。此外，有研究報道,microRNA-21在血管平滑肌和心肌細胞增殖和凋亡中亦扮演了重要的角色[13]。

綜上所述，提高心肌microRNA-21表達水平可減少心肌梗死面積，因而有可能成為心肌梗死基因治療的新靶點，但其具體機制尚需進一步研究。

?

張小花(1986-)，女，漢族，碩士，住院醫師，研究方向：冠心病的預防和治療

參考文獻

1Shinji K,Atsuo A.BRCA1 regulates microRNA biogenesis via the DROSHA microprocessor complex[J].Cell Biol,2012,197(2):201-208.

2Dong S,Cheng Y,Yang J,et al.MicroRNA expression signature and the role of microRNA-21 in the early phase of acute myocardial infarction[J].Biol Chem,2009,284(43): 514-525.

3Si H,Sun X,Chen Y,et al.Circulating microRNA-92a and microRNA-21 as novel minimally invasive biomarkers for primary breast cancer[J].Cancer Res Clin Oncol, 2013,139(2): 223-229.

4Dong S,Ma W,Hao B,et al.microRNA-21 promotes cardiac fibrosis and development of heart failure with preserved left ventricular ejection fraction by up-regulating Bcl-2[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014，7(2): 565-574.

5Olivetti G,Capasso JM,Meqqs LG,et al. Cellular basis of chronic ventricular remodeling after myocardial infarction in rats[J]. Circ Res,1991,68(3):856-869.

6Fang J, Song XW, Tian J, et al. Overexpression of microRNA-378 attenuates ischemia-induced apoptosis by inhibiting caspase-3 expression in cardiac myocytes[J]. Apoptosis,2012,17(4):410-423.

7Dangas GD, Caixeta A, Mehran R, et al. Frequency and predictors of stent thrombosis after percutaneous coronary intervention in acute myocardial infarction[J]. Circulation,2011,123(16):1 745-1 756.

8Zile MR, Mehurg SM, Arroyo JE,el al. Relationship between the temporal profile of plasma microRNA and left ventricular remodeling in patients after myocardial infarction[J]. Circ Cardiovasc Genet,2011,4(6):614-619.

9Tang Y, Wang MH. MicroRNA-21 protects cardiomyocytes from tumor necrosis factor-alpha induced apoptosis in vitro via modulating PTEN/AKT/FOXO3a pathway[J]. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi, 2013, 41(2): 135-142.

10Chung AC, Dong Y, Yang W,el al. Smad7 suppresses renal fibrosis via altering expression of TGF-beta/Smad3-regulated microRNAs[J]. Mol Ther,2013,21(2):388-398.

11Zhou L, McMahon C, Bhagat T, et al. Reduced SMAD7 leads to overactivation of TGF-beta signaling in MDS that can be reversed by a specific inhibitor of TGF-beta receptor I kinase[J]. Cancer Res,2011,71(3):955-963.

12Wu JJ, Weis MA, Kim LS,et al. Type III collagen, a fibril network modifier in articular cartilage[J]. Biol Chem,2010,285(24):18 537-18 544.

13Yang Q, Yang K,Li A,et al.Anti-apoptosis and expression of microRNA-21 in rat myocardium during early ischemia-reperfusion injury[J].Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 2013， 38(5): 483-489.

作者簡介：本文第一

[中圖分類號]R541.4

[文獻標識碼]A

[文章編號]1005-1740(2015)04-0028-04

doi：10．3969／j．issn．1005－1740．2015．04．007

微循環學雜志，2015，25（4）：28－31

? 2015 CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATION